口腔微生物应用在龋风险评估模型中的研究进展
龋病是一种常见的发生于牙齿硬组织的慢性感染性疾病。2017年全球疾病负担研究结果显示，约24亿人口患有恒牙龋齿，5.32亿儿童患有乳牙龋齿。中国第四次口腔健康调查显示，成年人患龋率为89%～98%，3～5岁儿童乳牙患龋率为71.9%。龋病及其并发症可加重或诱发全身性疾病，严重降低人类生活质量，带来沉重经济负担。
对患者进行龋风险评估（caries risk assessment，CRA），预测患者在特定时间段内新发生龋齿或已存在病变的活跃性发生改变的可能性，可以帮助临床医生制定个性化龋齿防治方案，是现代龋病防治的基础之一，具有重要的社会意义。龋病是由生物膜介导的、糖驱动的、多因素决定的进行性疾病，细菌在龋病的发生、发展中起到关键作用。
目前比较主流的非特异性菌斑假说认为，龋病是菌斑微生物共同作用的结果。随后，基于描述龋病事件的生态学原理，有学者提出了“生态菌斑假说”，认为频繁摄入可发酵糖等行为能够破坏口腔微生物的平衡状态，其中产酸和耐酸细菌的比例和活动增加，提高了致龋风险。该假说目前被普遍认为是对龋病微生物病因最合理的解释。有大量研究表明，口腔微生物的组成和代谢功能在有龋和无龋人群中有显著差异。因此，口腔微生物被认为是龋齿的生物标志物之一，已被多种CRA 模型纳入使用。
现有的关于CRA 模型中口腔微生物龋风险预测能力的外部验证多围绕经典模型如CAT、Cariogram、CAMBRA 等开展，数量较少且结论不一致，目前没有公认最佳的口腔微生物评估方法。本文将就口腔微生物指标在CRA 模型中的应用进展进行一综述，总结其龋风险预测能力的外部验证结果，并就如何更好地利用该指标提出建议。
1.经典龋风险评估模型中微生物指标的应用和评价
目前，较多被广泛认可的CRA 模型都纳入了口腔微生物指标，在实际应用中可选择性评估。一般将纳入了生物学指标（例如微生物含量和唾液测试）等全部龋风险评估指标的模型称为完整模型，将未纳入生物学指标的模型称为简化模型。CRA 模型评估口腔微生物的内容和方法各有不同，例如附着板试验、菌斑酸碱度测试等，都旨在体现其致龋能力，使龋风险评估更为详细、全面。
与之相对的是评估微生物指标目前需要额外的材料、人员培训和工作程序等，带来了更高的经济和时间成本，不便于在社区大规模筛查时使用。因此，应合理应用口腔微生物指标，使其可以有效提高CRA 模型的龋风险预测能力。有学者建议，先使用简化模型筛选出具有潜在高龋风险的人群，后续结合生物学检查使评估更精准，同时降低评估成本，有利于公共卫生资源针对性地应用于龋病高风险人群。理想状态下，微生物指标应提高CRA 模型的敏感性，同时不应明显降低模型的特异性。
1.1 龋风险评估工具（caries-risk assessment tool，CAT）
CAT 是由美国儿童牙科学会提出的针对0～5 岁儿童和6岁以上人群的两类评估量表。该模型中纳入高水平变异链球菌作为0～5 岁儿童高风险指标，并通过附着板试验评估。采集受试者舌背唾液并置于变异链球菌选择性培养基中培养，随后观察附着板表面菌落密集程度并与标准板进行对比，评估唾液变异链球菌数量等级。
Gao 等在香港学龄前儿童中开展的1 年纵向试验发现，CAT 完整模型和简化模型都具有极高的敏感性（＞98%）和极低的特异性（＜6%），口腔微生物对于模型预测能力的提升作用很小。
1.2 Cariogram 模型
Cariogram 模型是1997 年瑞典学者Bratthall、Petersson 等研发的基于计算机算法的定量龋风险评估模型，通过内置公式对患龋经历、饮食习惯、变异链球菌水平等9 个风险指标的评分进行加权分析，最终使用饼状图展示各类风险因素对个体患龋风险的影响程度。该系统认为变异链球菌水平可以反映菌斑致龋能力，而乳酸杆菌水平可以一部分反映碳水化合物摄入情况。这两种代表性致龋菌的含量通过附着板试验测试，并分别与菌斑水平和饮食情况结合，用于评估微生物因素及饮食因素在受试者患龋风险中的作用大小。
Su 等荟萃分析认为完整模型与筛查模型区分不同龋风险人群的能力接近，然而完整模型的准确度较差；Birpou 等发现Cariogram 完整模型对于学龄前儿童龋病的预测具有更好的敏感性和预测能力，但其特异性较弱；另外，也有多篇文献报告两个模型的预测能力并无显著差异。
1.3 新加坡国立大学龋齿风险评估（NUS-CRA）模型
NUS-CRA 模型是2000 年由Gao 等学者提出针对学龄前儿童的定量龋风险评估模型。该模型共评估了人口学、行为、微生物等5 类龋风险因素，其中微生物因素纳入了唾液变异链球菌、乳酸杆菌、菌斑酸碱度3 个指标。菌斑酸碱度可以体现口腔微生物数量和致龋性、饮食习惯、唾液分泌率和缓冲能力以及它们之间的交互作用，被作为该模型的最强预测因子，也是该系统的独特之处。开发者随后在其他人群中开展了验证试验并发现，完整模型的预测能力略强于简化模型，但差异不明显。
1.4 龋齿风险评估管理（caries management by risk assessment，CAMBRA）系统
CAMBRA 系统是由加利福尼亚牙科协会提出的基于风险评估，指导龋病的早期防治的口腔健康管理工具。CAMBRA系统使用量表的形式，评估疾病指标、危险因素和保护因素3 类龋风险因素共20 多个指标。医生通过评估受试者各指标的风险等级并比较它们的平衡关系，评估未来牙齿脱矿的风险等级。唾液微生物水平作为附加评估选项，在该模型中的意义更多在于激励患者、反馈口腔抗菌治疗效果。
Gao 等发现与简化CAMBRA 模型相比，完整模型的敏感性和特异性达到了良好的平衡，即敏感性和特异性之和大于160%且两者较均衡。
2.微生物指标在龋风险评估模型中的新应用
上述经典的CRA 模型注重评估患龋经历、环境因素等对龋病发生的作用，而选择性评估口腔微生物因素且方法简单，例如仅评估唾液变异链球菌计数。根据生态菌斑假说，仅分析单一或有限菌种的含量难以全面反映口腔复杂微生物的综合致龋能力，预测微生物对龋病发生的影响需要对口腔微生物整体进行评估。由Shimono 研发的龋易感检测技术（Cariostat）利用菌斑微生物产酸使酸碱指示剂变色的原理评估微生物产酸能力，并使用龋态值表示。有纵向研究表明，龋易感检测技术可以有效预测3 岁儿童患龋风险。
Pang 等评估中国青少年龋态值并结合环境和遗传因素构建了龋风险预测模型。Kim等利用龋态值、含氟牙膏的使用和唾液分泌率3 个指标来构建韩国青少年简化龋风险预测模型。龋易感检测技术有望在未来帮助临床医生开展青少年、儿童龋风险评估和口腔健康综合管理。高通量测序技术揭示了龋病的发生与复杂的细菌群落有关，而不仅仅是单一菌种；龋病相关微生物群落的结构通常与健康微生物群落存在差异。
近年来有许多学者对口腔微生物进行细菌多样性和菌群结构分析，并结合机器学习法构建CRA模型。Grier 等使用Illumina 测序技术追踪儿童口腔菌群组成变化，并使用随机森林法构建CRA 模型，筛选出变异链球菌、黏液罗氏菌和小韦荣菌作为龋病生物标志物。Wu 等对母亲-儿童口腔微生物进行Illumina 测序，结合口腔卫生情况、行为因素等参数，创建了基于套索回归的CRA 模型。其中，普雷沃氏菌、白色念珠菌、奇异劳特普罗菌等被视为预测能力最强的微生物。
Teng 等使用罗氏454 测序技术结合随机森林模型筛选与龋病最具相关性的细菌种类，使用变异链球菌、非典型韦荣球菌、普雷沃氏菌等20 个细菌物种构建了儿童CRA 模型，并认为菌斑相较唾液具有更准确的龋病预测能力。Zhang 等在Teng 的研究基础上，通过实时定量PCR 技术检测儿童唾液龋病相关细菌绝对数量，并选用变异链球菌和苍白普雷沃菌构建严重低龄儿童龋（severe early childhood caries，S-ECC）诊断模型，在难以进行菌斑取样的情况下具有潜在应用价值。
近十余年来，多种更先进的微生物检测技术，如宏基因组学、代谢组学等正逐渐被应用于口腔微生物领域，揭开了口腔微生物活动与功能的神秘面纱，对龋病发病机制有了进一步的理解，也有望为CRA 模型中微生物指标的应用提供新的切入点。宏基因组学可以更精准地鉴定病原体，并且可以将分类学与功能联系起来，预测微生物在多样环境中的潜在功能。近年来有较多针对儿童口腔微生物进行宏基因组测序的研究。
Wang 等发现ECC 儿童唾液微生物代谢基因、通路和板块发生了广泛的改变，包括上调的糖代谢功能；Al-Hebshi 等在种和菌株水平鉴定ECC 核心致龋菌，并发现了与龋病相关的功能特征，例如尿酸盐、维生素K2 的合成；Tang 等发现S-ECC 儿童唾液细菌在涉及糖酵解和代谢的功能途径显著上调；Blostein等发现了与抗生素生产和耐药性有关的直系同源基因在患者菌斑中更为丰富，在京都基因与基因组数据库（Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes，KEGG）的分析结果显示，氧化磷酸化途径在患者菌斑中富集。
这些研究提示功能类别的相对比例测量具有应用到CRA 模型中的潜能。代谢组学可以反映其他分子组层表达和调节的所有信息，揭示微生物当前的生理活动，因此，该方法正处于个性化诊断和治疗的前沿。Havsed 等使用核磁共振技术识别和量化青少年菌斑代谢物，发现有机酸、乙醇等有机物分别与耐酸和健康相关细菌有显著聚集关系，因此，这些化合物之间的比例关系可能具有潜在的龋风险预测价值。
3.总结与展望
龋风险评估（CRA）模型基于龋病发生的生物学因素、危险因素和临床检查结果等，预测人群或个体未来新发生龋齿或龋活跃状态发生改变的可能性，为制定公共卫生政策或临床个性化龋病管理策略提供参考。口腔微生物作为龋病发生发展的关键因素，被广泛运用于CRA 模型中。现有的CRA 模型采用了多种评估口腔微生物的方法，例如附着板试验、菌斑酸碱度检测、龋易感性检测等。
目前的研究证据尚不足以支持附着板试验可以有效提高CRA 模型的龋风险预测能力。首先，附着板试验的准确度和精密度缺乏验证；其次，有流行病学证据表明，唾液中变异链球菌含量与宿主患龋情况无明显关联，仅单一唾液菌种的数量只是龋齿风险的弱预测因子；另外，唾液微生物评估龋风险能力可能不如菌斑微生物，因为后者直接作用于牙齿表面。
其他微生物评估方法如菌斑酸碱度检测的预测能力尚缺乏系统的评价，还需进一步在扩展人群中进行验证。而利用高通量微生物测序结合机器学习的CRA 模型，缺少其他龋风险因素的评估，且使用的样本量较少，代表性不足，还需要进行更大规模的研究。就如何提高口腔微生物的龋风险预测能力，笔者认为在来自不同环境的人群中对现有CRA 模型进行验证，并系统性评估口腔微生物龋风险预测能力，有助于发现其不足之处，为改进微生物指标的应用提供线索。其次，评估口腔细菌以外的生命体活动对患龋风险的影响十分必要。
已有多项研究表明，真菌和噬菌体具有重要致龋作用，Wu 等研究也证明了白色念珠菌对龋风险预测的重要意义。另外，在龋病的发生发展过程中，口腔微生物的代谢活动被认为是重要的调节因素，评估口腔微生物致龋能力，不仅要评估其分类组成，更应评估其代谢和功能特征。已经有许多研究通过宏基因组、转录组、代谢组等多种先进的微生物检测手段，发现了龋病相关代谢通路与产物特点，有望筛选出微生物龋风险标志物，从实验室走向临床应用。
近年来，机器学习被应用于CRA 模型的开发探索中，相对于简单逻辑量表有更低的误差和偏移风险。结合机器学习与微生物测序技术，精确识别龋病相关口腔微生物开发的多个CRA 模型展现了机器学习结合口腔微生物群特征在龋风险评估中的巨大潜能。未来的研究应尝试利用机器学习与宏基因组学、代谢组学等先进的微生物检测技术结合，识别微生物龋病相关代谢特征，并与其他龋病相关风险因素共同构建CRA 模型。
