口腔扁平苔藓损害组织中幽门螺旋杆菌DNA的原位检测及其意义

　　提　要　为了进一步探讨口腔扁平苔藓（OLP）与幽门螺旋杆菌（HP）的关系，本研究应用非放射性DIG系统的原位杂交技术对20例HP-PCR阳性的OLP患者作HP-DNA的检测。结果显示：在20例OLP的损害组织中，18例为HP-DNA阳性，2例为阴性，而对照组均为阴性。结果提示OLP损害组织中HP所致的病理变化可能是某些OLP的发病基础。

　　关键词　口腔扁平苔藓　　幽门螺旋杆菌　　原位杂交

材料与方法

　　1.载玻片与盖玻片的处理

　　载玻片的处理：①将玻片插入染色架，加入含中性洗涤剂热水中处理至过夜；②用流水冲洗、晾干后，置清洁液中浸泡48h；③用流水冲洗干净，去离子水漂洗，晾干，干热180℃处理3h；④无水乙醇脱水30min，晾干；⑤配3×SSC、1×Denhardt\s液，加热至65℃，将载玻片浸在上述液体中处理3h；⑥冷却后除去上述液体，用去离子水漂洗1min；⑦3∶1（乙醇：冰醋酸）浸育20min，晾干；⑧在2％氨丙基三乙氧基甲硅烷（APES）中浸10秒，丙酮轻洗，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水洗后，42℃温箱过夜，干燥，贮存备用。

　　盖玻片的处理：①中性洗涤剂浸泡过夜，用流水洗涤，晾干；②清洁液浸泡48h后流水冲洗，去离子水漂洗，晾干；③配5％硅油溶液，硅油用氯仿稀释，盖玻片放入5％硅油中片刻取出；④用去离子水漂洗2次；⑤80℃烘烤3h，收入盒中备用。

　　2.标本的制备

　　取HP-PCR检测阳性的OLP石蜡标本20例。所有的标本均按原位杂交要求处理：①在4％多聚甲醛磷酸缓冲液中4℃固定过夜；②70％、80％、90％、100％乙醇脱水（4℃、1h）；③将脱水的标本放入二甲苯中透明，每1～3h换3次后在4℃过夜；④60℃浸蜡3次，每次2h；⑤石蜡包埋，5μm连续切片，37℃温箱过夜，4℃干燥保存。上述处理过程中所有器具及溶液均按无RNA酶要求处理。

　　3.主要试剂

　　地高辛标记寡核苷酸加尾试剂盒、DIG核酸检测试剂盒及蛋白酶K均购自德国Boehringer Mannheim公司。DEPC、APES购自上海华美生物工程公司。其它试剂均为国产分析纯。

　　4.探针的制备

　　取HP-PCR检测试剂盒中的下游引物作为寡核苷酸探针（28个碱基）并经DNA合成仪合成而得。探针的标记：①依次将4μl加尾缓冲液、4μlCOCl2溶液、1.5μl寡核苷酸探针（100pmol)、1μlDIG-dUTP溶液、1μldATP溶液、1μl末端转移酶混合于Eppendorf管中后置于冰上；②37℃孵育15min，然后置于冰上；③取1μl糖原和200μl0.2MEDTA溶液混合（pH8.0)，从中取2μl加到反应混合物中以终止反应；④用2.5μl4MLiCl和75μl预冷的酒精（-20℃）绝对混合以沉淀加尾标记的寡核苷酸，-20℃放置2h；⑤在离心力12000g条件下离心30min，用70％（v/v）、50μl冷酒精清洗，冷冻真空干燥离心30min，溶解于100μl消毒双蒸水中，置-20℃冰箱贮存备用。

　　5.原位杂交检测HP-DNA操作步骤［3，4］

　　5.1　切片的预处理

　　用吹风机吹干从冰箱中取出的切片，二甲苯脱蜡3次，每次10min，再依次放入100％、90％、80％及70％乙醇中各5min，0.1M、pH7.4PBS洗2次，每次15秒，0.2MHCL20min，2μg/ml蛋白酶K溶液（10mM Tris-HCLpH8.0.1mMEDTA)处理15min，0.2％甘氨酸.PBS各洗10min，用4％多聚甲醛后固定5min，PBS洗2次，然后用0.25％醋酸酐/0.1M三乙醇胺溶液（pH8.0)处理10min，PBS洗2次，最后分别用不同浓度乙醇（70％、80％、90％和100％）脱水，晾干。

　　5.2　杂交

　　新鲜配制杂交液：50％甲酰胺，4×Denhardt\s，10％硫酸葡聚糖，0.5mg/ml变性鱼精DNA，0.25mg/ml酵母tRNA，10mM Tris-HCLpH7.4.1mMEDTA及标记探针，终浓度为1μg/ml。在组织切片上滴加杂交液50μl，上覆盖玻片，置95℃热板上6min，使靶DNA变性，然后将载玻片于冰上冷却1min，放入经50％甲酰胺湿润的湿盒内，42℃孵育3～8h。

　　5.3　杂交后漂洗

　　杂交后，取出载玻片浸入2×SSC中，洗去盖玻片和杂交液。然后在摇床上先用2×SSC漂洗2次，每次15min，再以0.1×SSC42℃漂洗2次，每次15min，以去除非特异性结合的寡核苷酸探针。