口腔生态环境中的纳米菌与口腔疾病间的关系
【摘要】 纳米菌较普通细菌小100%，能产生坚硬的矿化外壳，参与结石的形成，与多种疾病有关。随着纳米菌生物学特性地不断揭示，纳米菌已经成为当今研究的一个热点。口腔生态环境中的唾液、牙表面、牙菌斑、牙石和髓石内存在着大量的纳米菌。本文在复习大量文献的基础上，就纳米菌的微生物学特性及其与口腔疾病的关系等作一综述。
20世纪90年代后期，纳米技术（nano tech-nology）异军突起，掀起了纳米微生物学研究的热潮，纳米菌（nanobacteria，NB）的发现是一个重要标志。下面就NB的微生物学特性、分离培养与检测、感染性及其与口腔疾病的关系作一综述。
1 纳米菌的微生物学特性
NB为革兰阴性菌，在自然界中广泛分布，呈球状或球杆状，细胞壁厚度为20～200 nm，可通过0.1～0.4 μm的滤菌膜[1-2]。NB可通过电子显微镜和其他高分辨率显微镜，如原子显微镜发现。NB在pH7.4的生理性钙磷溶液中能形成羟磷灰石碳酸盐结晶，产生坚硬的钙化外壳覆盖于菌体周围，在高温、强酸等条件下仍能存活。分类分析表明，NB属于真菌属（Eubacteria）[3]。
NB不能用普通微生物培养基培养，但能用细胞培养基培养。洗涤过的NB在无血清培养基中生长缓慢，聚积成群，产生1个约数微米厚的钙化壳，牢牢地黏附在培养皿上。加入灭菌血清后，钙化壳消失，表现为可移动、易变形的NB。NB生长缓慢，每3～6 d增殖1次[3]。基因序列分析表明，NB与原核细菌α2亚群的布鲁菌和巴尔通体近缘，具有相同的16S rRNA序列[4]。
2 纳米菌的分离培养与检测
2.1 纳米菌的分离培养
目前，NB的分离与培养方法已成熟。常用的分离方法是纳米孔径滤膜滤菌法[5]。取NB感染标本如唾液，用经高温灭菌并经0.22 μm滤膜过滤的生理盐水（电镜观察时该盐水将作为对照）稀释为50%的体积分数，15 000 r/min离心45 min，取管底溶液经0.45 μm孔径滤膜过滤，生理盐水稀释为50%的体积分数，15 000 r/min离心45 min，取管底溶液经0.22 μm孔径滤膜过滤，滤液即为NB分离液。
将NB分离液置于经0.22 μm滤膜过滤的1640培养基或其他细胞培养基中，在37 ℃，体积分数5%～10%的二氧化碳温箱中培养，3～4周后经观察、鉴定即可判定NB的增殖。
2.2 纳米菌的检测
NB的检测有以下3种方法[6]：1）DahlMcGec-Russel素红钙染色和异硫氰酸荧光素染色，电镜下观察球状或球杆状的NB；2）异硫氰酸荧光素染色，免疫荧光测定；3）滴加小鼠NB单克隆抗体，二氨基联苯氨溶液显色，酶联免疫吸附测定。此外，还有能对血液中的NB抗原和抗体进行检测的方法（NanobacTEST-S法）和通过尿液来检测NB的快速检测方法（NanobacTEST-U/A法）[7-9]。而NanobacTEST-S法只能对复活的NB进行检测，却不能测定处于休眠状态的NB，因此更精确的检测方法还需进一步的研究。
采用上述NB分离培养与检测方法，Kajander等[4，10]成功地在人类血液、肾结石等组织以及多种动物的血液、肝、脾等组织中分离培养出了NB。
3 纳米菌的感染性
研究表明，NB能感染机体任何组织和细胞，通过分子模拟和胞吞作用与被感染细胞建立一种寄生关系，发生细胞内外钙化，具有明显地促核作用。同时，NB通过分泌一些细胞毒素，如内毒素等引起受感染组织的炎症并出现相关炎性因子如白细胞介素、热休克蛋白、基质金属蛋白酶等，引起被感染细胞死亡[10]。NB在体外能攻击3T6成纤维细胞，引起细胞内钙盐沉积，被感染的细胞出现核变性、核形态改变或细胞溶解。
4 纳米菌与口腔疾病
目前，国内外对于NB与口腔疾病之间关系的研究甚少，故笔者介绍一下国内外研究涉及的NB与其他疾病的关系，从而延伸到口腔疾病的范畴。
4.1 纳米菌与牙石和牙髓石
NB在生长增殖过程中能分泌羟磷灰石类的钙化物，形成钙化生物膜，刺激机体产生以NB为核心的钙化病变。多项研究表明，NB与肾结石、胆结石、膀胱结石等疾病的发生相关。
Kajander等[10]对30例肾结石标本进行NB培养鉴后定，均得到阳性结果。Ciftcioglu等[11]对72例芬兰肾结石患者的肾结石标本进行NB培养和单克隆抗体免疫荧光染色鉴定，其中70例患者的肾结石标本NB检测呈阳性，表明97.2%的肾结石含有NB。Khullar等[12]应用培养的NB经皮肾内注射，建立NB致大鼠肾结石的动物模型并提出肾结石形成的新学说，即NB感染在肾结石的形成过程中作为结石核心而发挥作用。国内最近有研究报道，肾结石和胆结石患者的血清和胆汁中均培养出了NB。
有学者通过对唾液和牙菌斑中NB诱导的生物矿化的试验表明，NB确实有可能诱导结石的形成。Ciftcioglu等[11]在口腔关于牙髓石的研究中证明了NB抗原的存在，而且他们在研究中还发现，患牙髓石的患者中，肾结石和胆结石的发生率都较高。他们以为，NB与肾结石、胆结石、牙髓石甚至牙石的形成皆有关。
4.2 纳米菌与动脉粥样硬化和口腔感染
2002年，Shiekh等[13]在冠心病患者的粥样斑块中发现了NB，这是继明确肾结石中有NB存在后的又一重大突破。Wood等[14]在100%的动脉粥样硬化患者的血清中发现了NB感染，用免疫荧光染色检测从这些患者的粥样硬化斑块中培养出来的NB，其阳性率达60%，从而推断NB在动脉粥样硬化斑块形成和固定中起重要的作用。
研究表明，冠状动脉粥样硬化可能与口腔的慢性感染有关。口腔疾病的慢性感染可能是诱发冠状动脉粥样硬化的因素之一[15]，但关于两者的关系目前尚无确切的证据可给予证明。Hung等[16]认为牙周疾病和外周动脉疾病之间的联系，可能是通过口腔感染途径介导的，因此他们认为NB可能在牙周疾病特别是牙龈炎和牙周炎及外周动脉疾病之间提供一种潜在的桥接关系。
4.3 纳米菌与口腔肿瘤
有研究表明，某些恶性肿瘤的细胞具有NB受体，能将NB导入细胞内并引起肿瘤的钙化。Hudelist等[17]发现，部分肿瘤细胞表面有NB黏附的受体，此受体已经von Kossa钙染色证实。因此他们推断，NB可能与肿瘤的发生有一定的关系。唐中华等[18]在电镜下观察到乳腺癌组织中的NB样颗粒，而在纤维腺病乳腺组织中未发现有NB样颗粒。因此他们认为，NB可能是乳腺癌钙化现象的原因之一。王学军等[19]在肝癌患者的肝组织中检出了NB，故他们推测是NB与慢性肝炎共同作用增强了宿主基因的突变而引发了癌变。
口腔肿瘤中也存在着有钙化现象的肿瘤，如牙源性钙化上皮瘤、牙源性腺样瘤和牙源性钙化囊肿等。由此能否推测NB与口腔肿瘤有关联，能否通过诱导肿瘤细胞增强NB受体表达，或利用改良的NB进行肿瘤治疗，将是一个十分有前途的研究课题。
5 应用前景
NB在许多疾病的发生、发展过程中起着重要的作用，其中大部分疾病是人类健康的主要杀手。随着人民生活水平的提高，人口的老龄化日益明显，有关疾病的问题将会更为突出。如能抑制NB的生长，即可有效地预防一些疾病的发生。国外有学者研究发现，四环素和柠檬酸钾可有效地抑制NB的生长[7]。相信如果NB的病因学理论能够确立，那将为这些疾病的预防提供新的、简单有效的方法。
