口腔粘膜下纤维性变组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化及定量分析

摘　要：目的：了解口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的分布及变化情况。方法：应用免疫组织化学方法观察Ⅰ型及Ⅲ型胶原在OSF中的分布，并应用图像分析仪对正常颊粘膜及OSF各期中的Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量分析。结果：Ⅰ、Ⅲ型胶原在口腔颊粘膜中均有分布；Ⅰ、Ⅲ型胶原随OSF病变程度加深逐渐增加，Ⅰ型胶原在OSF早、中、晚三期增多均有统计学意义，而Ⅲ型胶原仅在OSF晚期增多有显著性差异。结论：随OSF病变程度加深胶原沉积逐渐增多，增多的胶原中Ⅰ型胶原为主要成份。

关键词：胶原；免疫组织化学；口腔粘膜下纤维性变

　　口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性胶原性疾病，妨碍口腔各种功能的发挥，世界卫生组织将其列为癌前状态疾病。现有的资料表明OSF胶原的增加是由于病变组织中胶原的代谢失去了平衡，胶原合成的增加和降解的不足导致了胶原纤维的堆积〔1,2〕。为探讨OSF的形成机制，作者以免疫组化手段观察了正常颊粘膜及OSF各期病变中Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布及其含量的变化情况，并分析其意义。

1　材料和方法

1.1　标本

　　病变组织来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊所收集的OSF患者颊部病变部位组织标本，对照组取自无嚼槟榔、无烟酒嗜好、身体健康的志愿者相应部位颊粘膜。病变标本请病理学专家确诊，并按Pindborg〔3〕的病理学标准进行分期。选择OSF早、中、晚期及正常对照各10例进行研究。

1.2　试剂

　　Ⅰ型胶原抗血清(兔抗牛、与人有交叉抗原性，工作浓度1∶50)

　　Ⅲ型胶原抗血清(兔抗人，工作浓度1∶50)。

　　以上两型抗体购自上海医科大学病理学教研室。

　　生物素化的二抗(美国Sigma公司产品，工作浓度1∶100)

　　S-P辣根过氧化物酶试剂盒(迈新生物制品有限公司，工作浓度1∶100)。

1.3　免疫组化染色

　　采用S-P(streptavidin-peroxidase)免疫组化法，标本常规切片，经水化，抑制内源性过氧化物酶，消除非特异性染色后，滴加第一抗体，4 ℃过夜；滴加生物素化第二抗体，室温30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片。以0.01 mol/L PBS代替第一抗体作阴性对照。

1.4　定量分析

　　在MIAS-160型(美国)自动图像分析仪下，每侧标本随机选取3个部位进行分析，取其平均值，测算Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性面积占目标面积(0.014 cm2)的百分比，统计分析用t检验，检验水准α=0.05。

2　结　果

2.1　免疫组化染色

　　正常颊粘膜中，I型胶原定位于整个粘膜固有层，呈较粗大的囊状，有规律的纵横交错(图1)。OSF早期I型胶原增多，分布与正常颊粘膜近似。OSF中期I型胶原增多更明显，主要定位于固有层深层，表现为粗大的条索状(图2)。OSF晚期I型胶原更多，形态增粗，部分区域呈团块状(图3)。Ⅲ型胶原在整个固有层中亦有分布，呈细网状，较纤细。从OSF早期到中期再到脱期Ⅲ型胶原逐渐增多，纤维增粗(图4)。

图1　正常颊粘膜中的I型胶原(×10)

图2　OSF中期颊粘膜中的I型胶原(×10)

图3　OSF晚期颊粘膜中的I型胶原(×20)

图4　OSF中期颊粘膜中Ⅲ型胶原增多(×10)

2.2　图像分析结果

　　Ⅰ、Ⅲ型胶原在正常颊粘膜及OSF各期中的百分比分别见表1、2。

 表1　I型胶原的百分比　　　　　　(±s)

表2　Ⅲ型胶原的百分比　　　　　　　(±s)

3　讨　论

　　胶原纤维是构成细胞间质的主要成分，现已分离出17种不同基因型胶原，各自间及种属间均有抗原特异性。I型胶原为间质型胶原，是绝大多数结缔组织中的主要成分〔4〕。本研究结果表明在正常颊粘膜中I型胶原占45.85%。同其他结缔组织相同，I型胶原是口腔颊粘膜的主要成分。Ⅲ型胶原占14.56%，说明Ⅲ型胶原也为颊粘膜中较多的一种成份。