棋盘式DNA-DNA杂交法检测中国人的龈下细菌

　　【摘要】　目的　检测牙周健康者和快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)患者的龈下细菌，旨在寻找RPP的主要致病菌。方法　采用棋盘式DNA-DNA杂交技术，将5名牙周健康者和6例RPP患者的84个龈下菌斑DNA样本与37种龈下细菌的DNA探针杂交。结果　埃氏腐蚀菌等6种细菌的检出率高于90%。牙周可疑致病菌，如伴放线放线杆菌血清b型、牙密螺旋体、具核梭杆菌具核梭亚种、佛赛类杆菌、变黑普菌、产琥珀酸沃廉菌、直弯曲菌、微小消化链球菌、中间链球菌和牙龈卟啉菌，在RPP组的检出率和细菌数均显著高于牙周健康组。结论　牙周致病菌具备一定数量才能引起牙周组织的破坏，RPP是由多种致病菌所致。

　　【关键词】　牙周炎　　细菌学　　脱氧核糖核酸

　　棋盘式DNA-DNA杂交法(checkerboard DNA-DNA hybridization)是一项分子生物学新技术，可以应用几十种DNA探针同时与多个样本的DNA杂交［1］。目前已知牙周病的可疑致病菌有多种，与其他细菌共同聚集在龈下菌斑中［2～7］，但有关我国牙周病患者的主要致病菌种类并不很清楚。本项研究采用棋盘式DNA-DNA杂交法检测我国牙周健康者和牙周病患者的龈下细菌，目的在于明确快速进展性牙周炎的主要致病菌。

材料和方法

　　1.研究对象：6例快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis，RPP)患者选自北京医科大学口腔医学院牙周科门诊就诊者，平均年龄33岁，病损呈弥漫性，受累牙多于14颗，有严重的骨丧失。另从该院职工中选择5名牙周健康者(简称H)作对照组，平均27岁。受检者无系统疾病，3个月内未服用抗菌素。2组受检者的牙周临床状况见表1。

　　2.细菌取样：去除每名受检者各8颗牙的龈上菌斑，用无菌刮治器从各牙的颊侧近中位点取龈下菌斑，人均8个标本，共88个。

　　3.细菌检测：采用37种龈下细菌的整组基因DNA探针［1］，用棋盘式DNA-DNA杂交技术检测了其中84份菌斑标本。

　　4.棋盘式DNA-DNA杂交技术步骤：将变性的DNA样本加到微槽板上，使DNA沉积在槽下的杂交膜上呈狭缝状，再用紫外线将DNA固定在膜上。将含DNA的膜转90°角放在微杂交板中间，与地高辛

 表1　牙周健康组与快速进展性牙周炎组的临床表现(±s)

　　PLI：菌斑指数　BI：牙龈出血指数　PD：牙周袋深度　AL：附着丧失　BL：X线片显示骨丧失≥2mm

表2　受检者和84个受检位点牙周可疑致病菌的检出情况

　　+：细菌检出阳性　-：细菌检出阴性　H：牙周健康者　P：快速进展性牙周炎患者

(Digoxigenin)标记的37种细菌的整组基因DNA探针杂交，再将膜与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应，最后用化学发光法和X线片检测杂交结果。84份菌斑标本共计3 108个杂交点。各细菌的检出以每张X线片上的标准细菌(分别定量为105和106)为参数，记录X线片上相应的影像［1］。细菌计数分为4级：0级未见杂交斑点；1级可见斑点，但影象密度和区域<105细菌量；2级杂交斑点的影象密度和区域在105～106范围；3级杂交斑点的影象密度和区域>106(图1)。资料分析：健康组和RPP组各种细菌检出率的差异用χ2检验，二组间细菌计数所得均数的差异用Kruskal-Wallis检验。