N6-甲基腺嘌呤RNA甲基化在口腔发育及相关疾病中的研究进展
RNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传学修饰方式，在不改变基因序列的情况下，导致基因的表达和功能的变化，其中最常见的是N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化修饰。m6A 可以发生在真核生物细胞的各类RNA，介导目标RNA 的各项生物学过程，对其表达和功能进行调控。
大量研究表明m6A 广泛参与各类干细胞的自我更新及分化、免疫反应以及肿瘤的发生发展过程。m6A是一种动态可逆的RNA修饰过程，主要由甲基转移酶(Writers，“编码器”)、去甲基化酶(Erasers，“消码器”)和甲基化识别蛋白(Readers，“读码器”)共同参与。
“编码器”主要是由甲基转移酶(methyl transferase，METTL)3、METTL14及肾母细胞瘤1关联蛋白(Wilms tumor 1 associated protein，WTAP)组成的复合物。“消码器”主要是肥胖相关基因(fat and obesity-associated protein，FTO)和AlkB同源蛋白5(Alkbhomolog 5，ALKBH5)。
典型的m6A 识别蛋白是YTH 结构域家族成员(YTHDF1/2/3和YTHDC1/2)及胰岛素样生长因子2-mRNA 结合蛋白2(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP)家族蛋白(IGF2BP1/2/3)。m6A 介导RNA 的出核转运、翻译起始，或导致其降解、剪切等，从而调控其表达水平。
1. m6A 与口腔颌面发育
口腔颌面发育的主要研究内容是颌面部及牙发育的过程和规律，各种牙源性干细胞在口腔颌面部发育及再生中发挥重要作用。近年来的研究结果表明m6A及其调节分子参与了口腔颌面部发育的过程。研究发现METTL3在出生14d后小鼠牙根区域细胞的表达显著高于第7天，Sp7-Cre；METTL3fl/fl小鼠的牙根明显变短，根部牙本质变薄。
METTL3通过m6A 提高核因子I-C(nuclearfactorI-C，NFIC)的翻译，促进人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)的牙本质向分化。另一项研究发现，ALKBH5在分泌成牙本质细胞和成熟成牙本质细胞中表达量显著升高。ALKBH5降低Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)的m6A并提高其半衰期，增强蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称AKT)的磷酸化水平，促进小鼠牙乳头永生化细胞系mDPC6T的牙本质向分化。而Dmp1-Cre；Alkbh5fl/fl小鼠的牙本质发育则明显受损。
在小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30的体外牙骨质向分化及体内异位成骨实验中，敲低FTO 会抑制其体内外分化效果。机制研究表明FTO 通过降低Runx2的m6A，减少YTHDF2介导的Runx2降解而增强其稳定性，促OCCM-30牙骨质向分化。牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一种具有自我更新能力和多能分化潜能的牙源性间充质干细胞。
METTL3敲低通过提高Polo样激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)的表达水平，导致DPSCs衰老、细胞周期停滞及凋亡率升高。在DPSCs成骨诱导过程中，整体m6A 水平及METTL3的表达均升高。METTL3 分别与阅读蛋白IGF2BP2 和IGF2BP2/3 合作调节ATP 柠檬酸裂解酶(ATP-citratelyase，ACLY)和柠檬酸转运体(solute carrier family 25 member1，SLC25A1)的mRNA 稳定性和表达水平。
METTL3敲低导致ACLY和SLC25A1的m6A和表达降低，抑制DPSCs的葡萄糖摄取和乳酸生成，降低其骨向分化潜能。牵张成骨利用骨骼的发育潜能而诱导骨骼延长，在比格犬下颌骨牵张成骨过程中各类m6A 调节分子的表达均升高。
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管化牵张成骨的关键细胞，在体外EPC血管化培养的过程中，METTL3的表达显著升高，METTL3促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxy kinase，PI3K)/AKT信号通路的激活，促进EPCs的血管形成能力，提升牵张成骨效果。
除了硬组织，METTL3也参与了舌背上皮的发育。K14-Cre；METTL3fl/fl小鼠的味蕾形成减少，而角质细胞形成增多；而METTL3过表达可以促进辐射后的味蕾修复。K14-Cre；METTL3fl/fl小鼠和对照小鼠舌上皮的m6A 甲基化测序发现，Hippo和Wnt通路的关键分子——大肿瘤抑制激酶1(large tumor suppressor kinase 1，Lats1)和卷曲类受体7 (frizzled 7 receptor，Fzd7)的终止子附近分别存在m6A位点。
METTL3敲除导致了Lats1和Fzd7的m6A 表达下降，干扰Hippo和Wnt通路，影响舌上皮发育。
2. m6A 与口腔炎症性疾病
口腔炎症是口腔组织对各种致炎因子及局部损伤所产生的防御性反应，多种上皮、间充质以及免疫细胞参与其中，这类口腔疾病主要包括牙髓炎、牙龈炎、牙周炎等。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的hDPCs体外牙髓炎模型中，m6A 和METTL3的水平上调。而敲低METTL3可以促进炎症抑制因子——髓分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)的剪接变体MyD88S的表达，从而抑制hDPCs中LPS诱导的各类促炎信号通路，提示METTL3通过调节MyD88的剪接而促进牙髓细胞的炎症反应。
研究者交叉分析了GWAS数据库中与牙周炎有关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)以及m6AVar数据库中与m6A 有关的SNP，发现了104个与牙周炎及m6A同时相关的SNPs。其中，65例出现表达数量性状位点(expression quantitative trait locus，eQTL)信号，最明显的SNPrs2723183调节白细胞介素-37(interleukin-37，IL-37)的表达而影响牙周炎的发展。
另一项对241例牙周炎患者的牙周样本和69例健康对照样本的RNA 微阵列分析中，评估了23个m6A 调控因子介导的RNA 修饰模式，探讨了m6A对免疫细胞浸润、免疫反应基因和人白细胞抗原基因等免疫微环境特征的影响。结果显示，牙周炎样本中17个m6A调节分子的表达异常，其中的15个差异能很好地区分牙周炎和对照样本。包括复发性阿弗他溃疡在内的口腔溃疡疾病同样伴随着炎症反应。
一项研究探究了m6A 相关的SNP影响复发性阿弗他溃疡的可能性。通过UKBB数据库中与复发性阿弗他溃疡相关SNP 和m6AVar数据库中与m6A 相关SNP的交叉对比，发现了11个显著与复发性阿弗他溃疡相关的m6A-SNP，其中SNPrs11266744可以调节C-C趋化因子受体2(C-C chemokine receptor-like 2，CCRL2)的表达并参与复发性阿弗他溃疡的病理过程。
3. m6A 与口腔肿瘤
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常见的头颈部肿瘤类型之一，目前尚缺乏特异肿瘤标志物并且早期症状不明显，故早期诊断及早期治疗是提高患者5年生存率的关键。研究发现OSCC中多种m6A调节分子的表达失衡，并且可以作为预后风险模型的预测依据。
在根据m6A调节分子建立的预后模型中，高风险组常表现出比低风险组更多的免疫细胞浸润、更高的趋化因子和受体表达以及更低的免疫检查点基因表达。联合分析显示存在m6A 修饰的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)也是可靠的OSCC 预后风险模型的预测依据，高风险组表现出了更高的免疫细胞浸润及氧化应激标志物等特征。
OSCC 细胞系和对照组的m6A 甲基化测序显示，OSCC细胞的m6A 富集于mRNA 的3’非翻译区域(untranslated region，UTR)和蛋白质编码区(coding sequence，CDS)的交界处，以及lncRNA 的整个基因组。METTL3及METTL14在OSCC组织以及细胞系中均较对照组显著增高，是影响OSCC患者生存期的独立预后因素。
多个研究表明，METTL3可以通过提高蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyl transferase，PRMT5)和细胞程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的m6A及表达水平、与IGF2BP1合作促进促癌基因BMI1的翻译、通过YTHDF1增加了原癌基因c-Myc的稳定性、增加丝裂原活化蛋白激酶p38的m6A 及表达，促进OSCC发展。而METTL14对OSCC的作用则有争议。
一项研究表明OSCC组织中METTL14的表达降低，而METTL14过表达可以减少皮下移植肿瘤的大小。METTL14介导真核翻译起始因子γ1 (eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1，eIF4G1)的m6A，通过YTHDF2降低其稳定性，促进OSCC细胞的自噬，抑制肿瘤发展。
另一项研究则表明OSCC组织和细胞系中METTL14表达升高，METTL14调节lncRNA MALAT1 的m6A 及稳定性，通过lncRNAMALAT1/microRNA-224-5p/赖氨酸去甲基化酶2A[lysine(K)-specific demethylase 2A，KDM2A]轴促肿瘤细胞增殖。关于“消码器”，FTO 在OSCC组织和细胞中表达升高，FTO 通过降低PD-L1、Yes关联蛋白1(Yes associated protein 1，YAP1)或eIF4G1的m6A 及其介导的RNA衰减，提高PD-L1、YAP1的表达，或提高eIF4G1表达而抑制自噬，促进OSCC发展。
关于“读码器”，异质核核糖核蛋白C(heterogeneous nuclear ribonucleo protein C，HNRNPC)是OSCC 的独立生物标志物，通过升高N-钙粘蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)、波形蛋白(vimentin)和抑制E-钙粘蛋白(E-cadherin)，引发上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)。
异质核核糖核蛋白A2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleo protein A2B1，HNRNP A2B1)的高表达与OSCC差预后密切相关，HNRNPA2B1富集于逆转录转座子LINE-1并促进其翻译，进而激活转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路，促进EMT。
IGF2BP2在OSCC 中的表达也明显增高，IGF2BP2通过结合己糖激酶(hexokinase2，HK2)mRNA 的3UTR m6A 位点，促进HK2稳定性，导致OSCC细胞能量代谢异常，促进肿瘤发展。在针对m6A 与环状RNA(circular RNA，circRNA)联合分析图谱显示，OSCC细胞中大量circRNA 发生了m6A甲基化并且其数量变化。
其中，m6A 修饰的circFOXK2的表达升高，m6A-circFOXK2被IGF2BP3识别后，通过结合葡萄糖转运蛋白(glucosetransporter1，GLUT1)mRNA的3’UTR区域，提高其稳定性和表达，促进OSCC 细胞的葡萄糖吸收、乳酸产生以及ATP水平，促肿瘤发展。
除了对OSCC 的发病机制的研究，METTL3在OSCC的药物治疗中也发挥着重要作用。别隐品碱是一种异喹啉类生物碱，可以降低METTL3的表达，抑制补缀同源物1(patched homolog1，PTCH1)的m6A和表达量，抑制OSCC细胞的增殖、迁移、浸润以及EMT。氧化苦参碱则通过抑制METTL3 及其介导的CXC 趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)m6A，降低CXCR4的稳定性及表达，抑制OSCC的生长和转移。
安罗替尼是一种较常用的抗癌药物，通过靶向成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)，抑制FGFR3/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路促进OSCC 细胞凋亡。而METTL3在OSCC细胞中通过m6A 降低FGFR3的稳定性而降低其表达，抑制其药敏性。
除了OSCC，人成釉细胞瘤肿瘤组织中mRNA、lncRNA及circRNA的m6A表达模式(包括m6A 发生的位点及比例)与对照组比较也存在差异，提示m6A参与了成釉细胞瘤的发展。
4.总结
综上，m6A及其调节分子通过靶向特定的目标RNA，发挥促进翻译、稳定性，或者介导降解、剪切的作用，在口腔相关的生理或者疾病过程中发挥了重要的调控作用。其中m6A调节分子及靶基因为相关疾病的诊治提供了新的干预靶点和思路。随着高通量测序等技术手段的快速发展，m6A 相关的研究已经取得了巨大的进步，大量研究揭示了m6A 调节分子-下游靶基因轴在特定过程中的作用。
但仍有更多m6A相关的科学问题等待解答，例如甲基转移酶复合物是否存在更多的成员和功能，口腔组织是否存在特异性的m6A 酶或者结合蛋白。在已有研究中，口腔肿瘤的相关研究结果显示肿瘤组织中总m6A水平及各类m6A 相关的调控分子都处于一个失调的状态，“编码器”或“消码器”的增加都对肿瘤的发生发展起到促进作用，但特定调节分子如METTL14对OSCC的作用也存在争议。因此，口腔发育及相关疾病中m6A的作用从实验室研究到临床前应用，尚有待更多探索。
