Wetern-Blotting在粘放菌5519 I型菌毛鉴定中的应用
〔摘要〕 目的：检测粘放菌5519 I型菌毛的纯度及Western-Blotting方法的特异性。方法：采用SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法。结果：粘放菌5519 I型菌Mr大部分为54 000，少部分为38 000。Western-Blotting检测结果与SDS-PAGE结果相一致。结论：Western-Blotting在粘放菌菌毛鉴定中具有高度特异性。
关键词 菌毛；SDS-PAGE电泳；粘放菌。Western-Blotting(免疫印迹技术)作为一种快速、灵敏的筛选抗原和抗血清技术，在研究领域中用来进行抗原特性的描述，具有高度的特异性〔1〕。为此，本实验拟采用本方法对提取的粘放菌5519 I型菌毛的抗原及抗体进行分析、比较，探讨菌毛的抗原纯度。
1 材料和方法
1.1 菌毛的分离和提取
1.1.1 细菌的培养 本实验采用T14V变异菌株粘性放线菌5519(只含I型菌毛)，转种于TSA培养基微氧培养48 h，经革兰氏染色及生化反应鉴定为该菌后转种于20 L TSB培养基中，微需氧培养48 h取出备用。
1.1.2 菌毛的分离 将2万ml细菌培养液经4 000 r/min离心，20 min后收集菌细胞，以生理盐水反复清洗3次后，收集菌细胞在超声波中进行粉碎，低温高速离心(48 300×g) 20 min，去除菌细胞及细胞壁碎片，上清液低温高速离心(160 000×g) 24 h后，取沉淀物于0.1 mol/L Tris-HCl(TBS)溶液中，反复超声、离心3次，加入过饱和硫酸铵4 ℃过夜，经反复透析、浓缩后取得纯菌毛提取物，测定菌毛总蛋白量(4 g/L)。
1.2 SDS-PAGE电泳
1.2.1 本实验采用SDS-PAGE 电泳凝胶为体积分数为12.5%分离胶和体积分数为3.5%浓缩胶。(试剂及电泳仪为Bio-RAD公司产品)。
1.2.2 取上述方法提取的抗原50 μl加入50 μl样本稀释液，混匀加热后上样(每槽10 μl)，并以标准蛋白分子量进行对照。
1.2.3 电泳电流为浓缩胶20 mA，分离胶30 mA，电泳时间约3 h。
1.3 转移
1.3.1 SDS-PAGE 电泳结束后，切下标准分子量及含有样本的凝胶条带，以考马斯蓝染色。
1.3.2 将走样凝胶板放置半干式转移槽中转移至NC膜上，然后剪下一条宽约0.3 cm条带，放置伊红染色液中染色，观察样品条带，余下NC膜放置含体积分数为0.3%吐温-20的PBS液中封闭过夜。
1.4 ELISA试验
1.4.1 将NC膜划成约0.3～0.5 cm宽，放置反应槽板中；1.4.2 用含吐温-20的PBS(pH7.4,0.02 mol/L)液洗涤1次；
1.4.3 加入兔抗粘放菌5519 I型菌毛多克隆抗体(效价为1∶64，另外方法制备、提取)，稀释浓度分别为1∶100，1∶200及1∶400，每槽加入1 ml，置37 ℃摇床温育1 h，然后反复洗涤3次，每次3 min；
1.4.4 加入羊抗兔酶标抗体(1∶100，1∶200及1∶400稀释)，每槽加1 ml，置37 ℃温育1 h后取出，反复洗涤3次，每次3 min；
1.4.5 加入DAB底物液和终止液，观察反应结果。2 结 果
2.1 SDS-PAGE电泳
从粘放菌5519 I型菌毛的琼脂糖凝胶电泳图像上可看到两条条带，与标准分子量相比较，一条相对分子质量大约为54 000，另一条大约为38 000(图1)。
图1 SDS-PAGE电泳
A粘放菌5519 I型菌毛提取物 B标准蛋白分子量
2.2 Western-Blotting检验结果
从Western-Blotting方法测定结果可以清晰地看到菌毛样品呈现二条带，与电泳结果一致(图2)
图2 Western-Blotting免疫印迹图
3 讨 论
3.1 I型菌毛的纯度
近年来，Western-Blotting 已被广泛地应用于研究蛋白质的纯度和抗原抗体的相互作用。与其它技术相比较，它主要通过利用生物分子间相互作用而予以特异性检出。这是因为亲和的甲、乙双方中，甲方被凝胶电泳分离已有了高纯度，再经印渍固定化，又使它获得了相对稳定性。印渍纸很薄，和凝胶相比，甲方是处在固定化介质表面，这又有了容易和乙方接近的机会，因为生物分子间相互作用具有高度特异性。当用乙方与之作用时，即使乙方处在其它分子群中，也能识别出甲方而发生相互作用，这就具有了高度灵敏性。因此，免疫印迹法所体现的高纯度、高稳定性和易接近性、高灵敏度，而且操作简便，装置简单以及多考贝等特点，使它成为探讨生物分子间相互作用的优良技术〔2〕。