人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆
目的：克隆人牙本质基质蛋白1( DMP1)成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出人DMP1成熟区的基因片段(约1.8 kbp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人DMP1成熟肽编码区基因片段。
关键词 牙本质基质蛋白1；聚合酶链反应；人
牙本质基质蛋白1(Dental Matrix Protein 1，DMP1)是牙本质基质非胶原蛋白的主要成员之一，为成牙本质细胞合成的磷酸化蛋白质。它不仅是成牙本质细胞重要的表面标记，而且在牙本质生物矿化中具有成核作用，调节矿化晶体的形态和生长速度，起着维持矿化组织的重要作用［1］。本文采用逆转录PCR方法，从合法引产胎儿切牙、尖牙和前磨牙牙乳头组织中克隆到DMP1 cDNA基因片段，并测定了其部分核苷酸序列。
1 材料和方法
本组所用9月龄胎儿为合法引产胎儿。无菌条件下暴露前磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙和乳前磨牙［2，3］，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
根据Hirst［4］等报道的人DMP1的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5\和3\端引物序列为：5\AAGAATTCTACGGAGGGTAGAGGTATCACACC3\，带有EcoRI酶切位点；3\端的引物序列为5\AAAGGATCCTGCAGATCCTTTCTTGCTTACTAGC3\，带有BamHI酶切识别序列。
载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体。限制性内切酶均购自Promega公司。
逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸分析与郝建军的报道相同［5］。
2 结果
2.1 总RNA
异硫氰酸胍一步法提取的人牙乳头总RNA电泳(图1)，所获得的总RNA无明显的降解
1.人牙胚组织总RNA
2.小鼠牙乳头组织总R
图1 人牙乳头组织总RNA琼脂糖凝胶电泳2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.8 kbp的特异扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物DMP1和重组质粒pBS/DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA/HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的DMP1 PCR产物
4.重组质粒pBS/DMP1
5.pBS/DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6.载体质粒pBS7.λDNA/PstⅠ 8.目的产物DMP19.阴性产物(未加模板)2.3 pBS-DMP1克隆的酶谱分析
重质粒pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(图2，第5道)，1.8 kbp的DMP1和2.96kbp的载体pBS。1.8 kbp的DMP1与 PCR的目的产物电泳条带(8和3道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(6道)平齐。重组质粒pBS-DSP的酶切图谱与预期的完全一致。ApaI 酶切pBS-DMP1可获得1.4kbp和3.4kbp两条带，这与文献报道的人DMP1序列的酶切位点完全一致(图3)［4］。
图3 重组质粒pBS-DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1 λDNA-PstⅠ
2,3 重组质粒pBS-DMP1经ApaI酶切
4,5 pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6 重组质粒pBS-DMP12.4 pBS-DMP1克隆的序列分析
DMP1成熟蛋白编码区基因克隆质粒pBS-DMP1部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列与Hirst等［4］报道的结果完全相同。
3 讨论
DMP1是牙本质主要非胶原蛋白的一种，是磷酸化程度高、酸性较强的蛋白质之一。1993年George等［6］在用多抗筛选SD大鼠成牙本质细胞-牙髓成纤维细胞复合体文库时发现了一种新的牙本质基质酸性蛋白，名命为AG1。随后他们［7］又用地高辛标记的核酸探针研究AG1在小鼠染色体的定位，发现其基因位于5q21，与fgf 5紧密相连，为了符合目前染色体命名规则，AG1被更名为牙本质基质蛋白1(DMP1)。