人牙髓细胞体外培养条件的优化
摘要目的：优化体外人牙髓细胞(HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、高糖DMEM以及标准型、合格型胎牛血清，分别比较原代牙髓组织细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均明显优于常用玻璃培养瓶；两种不同型号胎牛血清比较为标准型胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均优于合格型胎牛血清；高糖DMEM适合于HPDC培养。结论：商品塑料培养瓶、标准胎牛血清、高糖DMEM是提高体外HDPC培养成功率的关键。
本实验在众多学者研究的基础上，进行优化体外人牙髓细胞(Human dental pulp cell, HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器 二氧化碳培养箱(SANYO，Japan)；倒置相差显微镜和照相系统(Nikon, Japan)；SZX-11超净工作台(整新电子仪器厂，上海)；50ml商品塑料培养瓶(GIBCO BRL， USA)；25ml玻璃培养瓶(上海)；Dulbeccos modified eagle培养液(高糖)(高糖DMEM)(GIBCO BRL， USA)；Hepes(Nacalai, Japan)；胎牛血清：合格型胎牛血清(qulified fetal bovine serium, QFBS)(GIBCO BRL, USA)；标准型胎牛血清(certified fetal bovine serium, CFBS) (GIBCO BRL, USA)。1.2 组织块培养方法参照司徒镇强［1］，略作修改。采用临床10～20岁因正畸阻生需要拔除的健康牙齿，在拔除后立即置入含双抗(青霉素，链霉素)的生理盐水内，于超净台上用750ml/L乙醇消毒。随后，正畸切钳沿牙根沟纹处切开牙齿，取出牙髓，不完全DMEM冲洗，剪切成1mm×1mm碎片，分割平铺于25ml玻璃培养瓶及50ml塑料培养瓶内，将瓶底向上，加入少量含150ml/L FBS的DMEM培养液，二氧化碳培养箱37℃培养4h，待组织贴壁后，将瓶底翻转平放，静止培养。
于倒置显微镜下观察组织块细胞生长状况。在组织块未长出细胞前，2周换液1次；待有细胞游出，则5d换液1次。当长出细胞铺满瓶底80%，即按1:2传代。比较塑料培养瓶与玻璃培养瓶细胞游出率。
1.3 HDPC来源鉴定取出已传代(3代)细胞，经2.5g/L胰酶消化后，将细胞以2×104/孔接种于放有1cm×1cm大小盖玻片的24孔板内，常规培养，待长满为单层时，取出，用ABC法行波形丝蛋白(Vimtin)单抗染色，光镜下观察。1.4 HDPC生长曲线取第3代细胞，2.5g/L胰酶消化，以每孔1万细胞接种。放入培养箱培养。分别于第1～7天取出，胰酶消化后行细胞计数，每时相3孔，取3孔均数。绘制生长曲线。1.5 两种型号胎牛血清比较 按上述原代培养方法，将已剪碎的牙髓组织放入商品塑料培养瓶内。分别加入150ml/L QFBS与CFBS， 比较两种型号胎牛血清细胞游出率。
2 结果
2.1 人牙髓细胞原代培养观察牙髓组织原代培养后第10天，组织块周围长出细胞，倒置显微镜下见细胞呈长梭形，细胞核椭圆，位于中央，胞浆均匀透亮(图1，2)。
图1 人牙髓细胞原代培养第10天 4×10
图2 人牙髓细胞原代培养第15天 10×10
2.2 两种培养瓶原代HDPC游出率比较
将原代培养组织块分别置入玻璃和塑料培养瓶内。培养72h后，每天观察组织贴壁、细胞游出情况，最后统计细胞游出及细胞长出最短时间(表1)。表1 两种培养瓶原代HDPC成活率比较
例数贴壁组织块
(块)细胞长出例数
(成活率%)细胞长出
最短时间(d)玻璃瓶 1810～252(12%)
28
商品塑料瓶1310～2512(92%)*7
经χ2检验 *P<0.012.3 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养作用比较
经观察发现：含CFBS的DMEM在商品塑料培养瓶内最为适合HDPC的生长，所培养例数，除1瓶外，其余12瓶均有细胞长出，而HDPC在含QFBS的DMEM中无细胞生长(表2)。表2 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养比较
合格型胎牛血清(QFBS)标准型胎牛血清(CFBS)
原代培养例数713培养瓶商品塑料瓶商品塑料瓶组织块贴壁差良好细胞成活(例数)无(0)有(12)
