冷冻疗法在口腔黏膜病治疗中的应用

   冷冻疗法又称冷冻消融术，是一种使用低温冷冻技术来破坏病损组织的技术。19 世纪中叶，英国学者詹姆斯·阿诺特（James Arnott）使用低温盐溶液作为冷冻剂用于乳腺癌和子宫肿瘤的治疗，是第一位将冷冻疗法运用于临床的医生。

    进入20 世纪后，干冰（固态CO2）、液态氧、液态氮等更高效冷冻剂的使用标志着现代冷冻疗法的开始，大大扩展了冷冻疗法的应用范围。随着现代成像技术的不断成熟和冷冻探针的出现，让冷冻疗法技术再次受到各科临床医生的重视。冷冻疗法技术涉及皮肤科、眼科、神经外科等多个领域，在微创治疗中亦有广泛应用。

    1.冷冻疗法的原理及机制

    冷冻疗法包括快速冷冻和缓慢解冻两个阶段的冻融循环，其治疗过程产生的细胞破坏机制较为复杂，一方面是低温对细胞产生直接损伤，另一方面是冷冻疗法可以促使组织缺血性坏死、诱导细胞凋亡以及诱导免疫反应而间接破坏组织细胞。

    1.1 低温引起的细胞膜结构损伤

    在较低的温度下，细胞脂质双层膜流体状态改变，细胞膜更具渗透性，使细胞内离子含量发生改变，当细胞恢复到正常生理温度时，细胞内离子变化会对细胞膜造成损伤。低温还会削弱膜蛋白和细胞支架蛋白之间的化学键，使细胞更容易受到机械损伤。

    1.2 细胞内外渗透压变化及细胞内冰晶的形成引起细胞损伤

    低温会先导致细胞外冰晶的形成。为了平衡细胞外溶液和细胞内溶液之间化学势的差异，水分子将通过细胞膜从细胞内进入细胞间质，导致细胞脱水和最初的细胞损伤。在随后的解冻过程中，水分子又从低渗性间质流入细胞内，从而导致细胞进一步受损甚至细胞破裂。而在第2 次冷冻过程中，细胞内水分子可凝结形成破坏力更强的细胞内冰晶，对细胞膜产生机械损伤，而缓慢解冻可延长这些破坏性影响的持续时间。

    1.3 微循环衰竭导致缺血性坏死

    血管内皮中形成的冰晶，可损伤血管内皮细胞并使病损旁的脉管系统收缩，从而导致微血管血液供应障碍。除了血管内皮细胞损伤外，解冻2 h 后，内皮细胞间连接也开始出现受损，导致毛细血管通透性增加、组织充血水肿。此外，受损的血管内皮与血小板接触，血小板聚集，最终形成血栓，引起局部缺血，导致组织出现缺血性坏死。这也是临床上冷冻疗法后病损极少出血的原因，也是冷冻疗法针对血管病变的优势。

    1.4 诱导细胞凋亡

    细胞凋亡被认为是肿瘤治疗的重要机制之一。已有研究发现，在冷冻疗法中，细胞凋亡参与了低温组织外围细胞的死亡，在冷冻疗法区域的外围组织出现Bcl-2 和Bax 蛋白表达上调引起的线粒体损伤，诱导细胞凋亡。低温冷冻疗法可与化疗相结合，以提高对患者肿瘤组织破坏范围的精确性，改善肿瘤患者冷冻疗法预后以及提高患者的生存率。

    1.5 免疫调节作用

    冷冻疗法后，组织内残留的坏死细胞可作为抗原，通过树突细胞呈递，诱导机体产生免疫调节作用。坏死组织释放出与损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活免疫应答，刺激如白介素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α)等免疫因子产生，增强对病损组织的破坏。

    2.冷冻疗法的方式

    冷冻疗法的效果受冷却速率、冷却温度、低温持续时间以及冻融循环次数影响。根据目前的研究发现，冷却速率是冷冻疗法中最重要的一个因素，快速冷却会产生细胞内冰晶，对细胞更具有破坏性，尤其是当降温速度超过每秒30 ℃，对病损组织破坏效率更高。此外，使用至少两个快速冷冻和缓慢解冻的冻融循环对病损组织的破坏更加有效。

    一般目标区域冷冻后至少要维持30 s，在下1 次循环开始前要对冷冻的组织进行缓慢解冻，通常需要2～3 min。冷冻剂剂量和递送方法的选择取决于病变的尺寸、组织类型和深度。

    按运送冷冻剂方式可将冷冻疗法分为：使用液氮喷雾剂或棉签的开放式系统，以及使用冷冻探针的封闭系统。开放式系统常用于较小的病损，冷冻剂和病损直接接触，可快速获得较好的冷冻效果，但是其缺点是操作准确性差，冷冻组织范围不易控制，另外直接暴露的冷冻剂也可能损伤周围正常组织；封闭式系统如冷冻探针，通过探针将冷冻剂递送至病损组织，探头有不同尺寸和形状，具有更好的可操控性，可以处理不同大小的病损。目前虽然开放式系统治疗的准确性较封闭式系统差，但其价格更加便宜、设备要求及操作更加简单，因此在门诊中应用更为普遍。

    3.冷冻疗法在皮肤病的应用概况

    冷冻疗法具有临床操作简便、时间短、出血少、感染风险低、伤口损害小、瘢痕少、美容效果好等特点。此外，冷冻剂便宜易得、部分治疗不需注射麻醉，并且患者不必缝合及拆线，治疗次数少。其安全方便、治疗效果稳定、不良反应少的特点使冷冻疗法在全身疾病的治疗得到了广泛应用，尤其在各种皮肤病领域，包括皮肤良性病变、皮肤癌前病变及皮肤恶性肿瘤的治疗。

    4.冷冻疗法在口腔黏膜疾病中的应用

    口腔黏膜疾病（如黏膜色素沉着、口腔扁平苔藓、口腔白斑病等）病损组织较表浅，通常涉及黏膜的上皮和浅层结缔组织，相对皮肤无毛发、毛囊等皮肤附属器，表面湿润光滑，是冷冻疗法技术应用的理想场所。冷冻疗法在许多口腔黏膜疾病中也取得不错的治疗效果。

    4.1 牙龈色素沉着

    虽然牙龈色素沉着在大多数情况下是生理的，但有关“黑牙龈”的美学问题是患者的关注重点。冷冻疗法是治疗牙龈色素沉着的有效手段之一。Arikan 等对21 例不伴有系统性疾病的、牙周组织健康的牙龈色素沉着患者进行了冷冻疗法。在进行冷冻疗法之前，将色素沉着的区域干燥隔湿，用4%的利多卡因喷雾进行表面麻醉，然后将四氟乙烷喷在棉签上，并立即在色素沉着的区域轻轻滚动。在每个治疗区域中将低温冷冻连续保持30 ～ 40 s，并使所有色素沉着的区域都经过1 次治疗。

    在治疗后第1、2 和4 周对患者进行复查，随后每6 个月随访1 次，直至30 个月。将术前测量的色素沉着区域与术后30 个月进行了比较，结果显示，所有患者的牙龈在治疗3 ～ 4 周后均完全愈合，无任何色素沉着。在随访期间，未观察到不良反应，并且直至30个月仍保持了良好的美学效果。

    Shirazi 等对15例青少年患者牙龈色素沉着使用液氮治疗。把术前照片分别和术后3、12 和24 个月拍摄的照片进行对比分析发现，术前和术后随访的牙龈颜色差异有统计学意义，冷冻疗法成功去除了患者牙龈的色素沉着。

    Kamboj 等为了评估液氮冷冻疗法和电烧灼技术对患者术后疼痛、伤口愈合和黑色素细胞密度的影响，对16 例患者进行了三盲随机对照试验，结果显示，这两种治疗方式对改善牙龈色素沉着均有效，但相比电灼烧法，液氮冷冻疗法在早期伤口愈合、黑色素细胞密度降低、患者疼痛减轻、色素沉着复发减少等方面具有显著优越性。以上研究表明冷冻疗法对牙龈色素沉着的临床效果显著，治疗效果稳定、复发率低，治疗操作简单，治疗过程疼痛少，创面愈合快且无明显瘢痕。

    4.2 口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP)

    OLP 属于口腔黏膜慢性炎症性疾病，OLP 的口腔病变难以治疗，常规药物治疗后易复发。局部应用糖皮质激素是针对有症状的OLP 的一线治疗方法。长期局部使用糖皮质激素类药物可能会出现一系列不良反应，如局部黏膜萎缩、口腔念珠菌感染等，且部分患者药物治疗效果不明显。

    为了寻找OLP 的替代疗法，Amanat 等将冷冻疗法作为一种新治疗方法与局部糖皮质激素传统疗法进行比较，选择了30 例具有双侧OLP 病变的患者，从每位患者中随机选择一侧病变使用N2O 气体进行冷冻疗法，另一侧的病变使用0.1%曲安奈德软膏局部治疗，治疗结果通过外观评分、疼痛评分来衡量病变严重程度，在治疗后第2、4 和6 周进行随访。

    结果显示，冷冻疗法在改善疼痛和病变程度方面与曲安奈德局部治疗一样有效，并且没有不良反应，但其样本量较少，随访时间较短，尚需要进一步的随机对照临床试验来支持。目前有关冷冻疗法应用于OLP 治疗的研究证据缺乏，但是仍可以考虑将冷冻疗法作为OLP 患者的潜在替代疗法或辅助疗法。

    4.3 口腔白斑病（oral leukoplakia，OLK）

    口腔白斑病是最常见的口腔黏膜潜在恶性疾患之一，早期发现和治疗对阻断口腔白斑病的恶变至关重要。尽管可以通过手术切除、激光手术和光动力疗法治疗口腔白斑病损，但冷冻疗法也是口腔白斑病的一种有效的治疗方式。

    Starzyńska 等选择了204 例OLK 患者，共有178（87.25%）例患者完成了6 个月的治疗和随访观察。其中74 例患者接受了0.05%维甲酸乳膏治疗，患者在患处局部涂擦维甲酸软膏，每天两次，至少8周；另外63 例患者接受了冷冻疗法，在局麻下使用N2O 作为冷冻剂，通过开放系统的喷涂方法进行，使用两个冷冻周期，每个冷冻周期为40 s，间隔2 ～ 3min；剩余41 例接受了外科手术治疗。

    在完成治疗后的第2、4、6、8 周和6 个月进行对照访视。结果表明，手术治疗与冷冻疗法之间的疗效差异无统计学意义，且在van der Waal 病理各分级中的疗效差异无统计学意义；与外科手术和冷冻疗法相比，局部应用维甲酸治疗的效果有限，但它可以减少OLK 病变的数量和大小，从而有可能减少冷冻疗法的范围。

    在另一项研究中，研究者使用液氮作为冷冻介质，使用开放系统的棉签法治疗60 个OLK 患者，治疗每2 周进行1 次，直到病变完全消退。经过平均6.3次冷冻疗法后，所有60 例患者的口腔白斑病损均完全消退。

    该研究认为冷冻疗法是一种简单、安全和易接受的治疗方式。这些研究表明，冷冻疗法对于OLK 治疗有效，相对其他治疗方法，具有方便、无需敷料、痛苦少、美观和安全的特点，更容易被患者接受。冷冻疗法有望成为OLK 治疗中传统手术的替代方案。但针对较大范围的OLK 病损，冷冻疗法范围不易精确控制，治疗常需分区域多次治疗。临床可以配合维甲酸治疗，缩小冷冻疗法的范围和数量；也可以对手术术后复发的小范围病损进行冷冻疗法，因此冷冻疗法联合局部药物治疗有望成为治疗OLK 的新方案。

    4.4 复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulcer，RAU)

    RAU 好发于无角化或角化差的区域，溃疡面一般直径2～3 mm 或更大。溃疡数量1 至数个，具有“黄、红、凹、痛”的临床特征，以及长短不一的发作周期。何丹林等利用液氮冷冻疗法治疗RAU 患者176 例，病损周围隔湿后，用棉签蘸液氮直接涂于患者口腔溃疡表面。

    治疗总有效率84.7%，显效117 例（66.5%），治疗1 次后自发痛消失，溃疡面缩小，溃疡周围红晕消失，上皮化生增快，3 d 内愈合；有效32 例（18.2%），经治疗1 ～ 2 次后，疼痛显著减轻，溃疡面缩小，溃疡渗出减少，逐渐愈合，愈合期4～6 d；无效27 例（15.3%），治疗后疼痛不减轻，溃疡愈合缓慢，愈合期较治疗前发作时无缩短。对68例患者随访2 年，复发频率治疗后较治疗前平均延长45.74 d。

    该项研究表明，液氮冷冻疗法的止痛效果迅速，局部灼痛消失快，治疗后能较快恢复患者的正常饮食并取得良好的疗效。冷冻疗法直接作用于溃疡面可以达到止痛消炎、促进溃疡愈合的作用，简单经济，危险性小，反应轻，没有明显的不良反应，溃疡面愈合后一般不留瘢痕。

    在冷冻疗法过程中，冷冻区域的神经传递会立即受到阻碍，神经元受冰晶影响以及局部缺血变化的综合作用而失活，但轴突鞘对冷冻具有抗性并保持完整，新神经元在治疗后可逐渐恢复再生。

    冷冻疗法治疗口腔溃疡止痛效果好可能的原因为：冷冻治疗后，溃疡病损及周围组织的局部神经元受损，使神经传导变得迟钝，疼痛因而减轻或消失。而冷冻疗法治疗口腔溃疡可缩短愈合期的原因，可能是低温冷冻破坏了溃疡组织，减轻了病损组织的非特异性炎症反应，阻断了溃疡形成因素的发展，使溃疡组织正常愈合。RAU 病因较复杂，病因及致病机制目前尚不完全明确，冷冻疗法可以作为局部对症的治疗方法，止痛、消炎、促愈合。

    4.5 其他应用

    4.5.1 脉管性疾病

    血管瘤与脉管畸形是来源于脉管系统的肿瘤或发育畸形，统称为脉管性疾病，约60%发生于头颈部，是口腔颌面部及口腔黏膜常见的良性病变。临床可用多种方法治疗，如外科手术、冷冻疗法、栓塞硬化、类固醇治疗和激光治疗等。Nogueira 等报告了1 例使用冷冻疗法的口腔黏膜血管瘤病例，该患者使用液氮喷雾的方法进行冷冻治疗，在18 个月的随访中病情稳定无复发。

    在Farah 等的一项回顾性研究中，对20 例接受封闭系统冷冻疗法的口腔黏膜脉管性疾病患者进行了分析，发现封闭式冷冻疗法系统获得100%的治愈率，95%的脉管性疾病消除后没有出现术后并发症，并且患者未报告术后出现疼痛。冷冻疗法可使组织周围发生微循环障碍导致缺血性坏死，治疗后很少有术后出血，因此冷冻治疗针对发生于口腔黏膜的脉管畸形病变具有一定优势。

    4.5.2 唾液腺囊肿

    唾液腺囊肿是口腔黏膜的常见病损，常发生在富含唾液腺的唇、颊、舌尖和口底黏膜。通常可通过外科手术切除黏膜囊肿，但常会引起并发症，如术后出血和神经损伤，对于学龄前儿童和老年患者而言，还要考虑手术的耐受性和患者配合程度。Garg 等报告了1 例冷冻疗法左侧口底唾液腺囊肿的6 岁患儿，局麻下利用冷冻喷雾冷冻4 个周期，每个周期持续5～10 s，在术后1 周及第1、3、6个月随访，病损消退无复发。

    为了评估冷冻剂治疗的有效性和便利性，Prasad 等在一项回顾性临床研究中，对20 例唾液腺囊肿患者进行冷冻疗法，表面麻醉后，以液氮为冷冻剂，使用棉签法冷冻唾液腺囊肿病损，患者在第2、7 天，第2、4 周，以及第3、6个月后随访，随后每隔6～ 12 个月随访1 次，平均随访时间为12 个月。所有20 例患者囊肿均完全消退，治疗后没有任何并发症并且在随访中没有出现复发。

    在Tsunoda 等的一项临床回顾性研究中，对24 例发生于唇或颊黏膜的小唾液腺囊肿患者进行冷冻疗法，并对患者的性别、年龄、患病时间、病变大小、总治疗次数和愈合时间进行评估。1 周后和每隔几周记录患者症状，如果未观察到病变减少，或病变仅有少许缩小，但病变仍持续存在，则再次进行冷冻疗法。在确认病变消失后，又进行了几个月的随访以确认是否存在复发。结果24 例患者，其中包括7 例学龄前儿童，在冷冻疗法期间和治疗后均未发生明显不良反应。

    该研究认为，冷冻疗法后病损的愈合进度不受患者年龄、病变大小或患者患病时间的影响。以上研究表明，冷冻疗法对口腔黏膜的唾液腺囊肿有效且复发率低，是一种简单安全的治疗方法，尤其是对于可能需要全麻下手术的学龄前儿童、对手术有恐慌心理的患者及手术耐受性差的老年患者，冷冻疗法是更容易被患者接受的治疗方案。

    4.5.3 病毒性疣、纤维上皮息肉

    冷冻疗法在皮肤病学中被广泛应用，被认为是皮肤脂溢性角化病、病毒性皮肤疣、纤维上皮性息肉等皮肤良性增生性病变的最佳治疗方案之一。病毒性疣、纤维上皮息肉等也常发生于口腔黏膜，冷冻疗法在皮肤病学的成功应用，提示我们冷冻疗法可成为治疗此类口腔黏膜良性增生性病变的潜在的治疗方案。

    5.小结及展望

    临床中，对前述这些病变的治疗常包括外科手术、电灼烧法、激光消融或光动力疗法等治疗方案。据目前文献报道，这些疗法可能会引起疼痛、焦虑、不适以及病灶复发。冷冻疗法优点包括：疼痛轻、相对便宜且易于使用；微创、出血少、愈合后几乎没有瘢痕；较保守，易接受，可用于特殊人群（如婴儿、老年人、焦虑症患者）及部分有外科手术禁忌证的患者；安全、可重复进行、不良反应少。

    冷冻疗法可以作为部分口腔黏膜浅表病变治疗的首选方案之一，也可作为部分口腔黏膜疾病的替代疗法或辅助联合治疗方案，以增强治疗效果。同样冷冻疗法也有缺点：冷冻疗法操作相对缺乏精确度和方便可靠的监测手段，难以精确判断组织坏死的最终体积，更依赖术者临床经验。

    尽管如此，对于某些患者，冷冻疗法的确是一种有价值的替代方法。冷冻疗法更广泛的应用尚需要提高对冷冻程度控制的精确性，以及更多的基础研究和临床试验，并针对每个可用于治疗的病变建立独立的治疗指南，以更好地应用冷冻疗法技术。