小鼠牙胚cDNA文库的构建
〔摘要〕 目的：构建具足够库容量的小鼠牙胚cDNA文库。方法： 先提取小鼠牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LD PCR扩增后，将双链cDNA 克隆到λTripleX中，包装噬菌体，以XL-l blue为受菌体滴定、扩增文库，用已知的牙胚 基质蛋白基因引物作PCR鉴定文库。结果：500 μl文库的库容量为1 .3×106 pfu，重组率为72%，从文库中克隆到已知的5种牙胚基蛋白基因。结 论：构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插入片段。
关键词 cDNA文库；小鼠；牙胚；信使RNA，聚合酶链反应牙胚是外胚层和外胚间充质经过相互诱导发育而来，在一系列的相互作用过程中，调控 牙胚分化的基因被激活，随后釉质和牙本质基质蛋白基因开放，最终导致牙齿的成熟。牙胚 发育中开放的调控和结构基因是该组织发育的关键和源泉，对于这些基因的结构和功能的研 究无疑有重要的生物学意义〔1〕。本研究采用PCR方法，构建小鼠牙胚的cDNA文库， 为筛选与牙齿发育有关的新基因打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
取3～7 d龄昆明小鼠(B6D2F1)的第一、第二磨牙牙胚，速冻于液氮并保存。
1.2 小鼠总RNA提取
按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书提取总RNA。从液氮中取出牙胚，称1 g敲碎，迅 速置研钵中，加液氮研成粉末，转至匀浆器中，待液氮挥发完全，加10 ml TripureTM Isolation Reagent充分匀浆，加2 ml氯仿混匀，作用5～10 min，离心取上清，加5 ml 已丙醇混匀置10 min，离心收集沉淀，φ=75%乙醇洗涤收集沉淀凉干，用515 μl DEPC水溶 解RNA，取10 μl作紫外定量分析，确定RNA浓度，取5 μl作琼脂糖凝胶电泳分析，确定RNA 是否降解。
1.3 小鼠PolyA+mRNA提取
按Promega 公司试剂盒说明书提取PolyA+mRNA。将上述提取的500 μl总RNA在65 ℃ 水溶中解聚10 min，加3 μl Biotinylated-Oligodt、13 μl 20×SSC室温孵育10 min， 将此退火的Oligodt-mRNA杂交产物加于含SA-PMP的柱上，经4次洗涤后，用洗脱液洗下Pol yA+mRNA，经乙醇沉淀洗涤后，用5 μl DEPC水溶解mRNA，取2 μl作琼脂糖凝胶电泳，确 定mRNA的分子大小及初步定量。
1.4 cDNA的合成
按Clontech PT3000-2 kit说明书进行。取3 μl mRNA作模板、1 μl Smart Oligonucleat ide、1 μl CDS/3’Primer、20 μl MMLV反转录酶合成第一链；取2 μl第一链cDNA作模板 、2 μl 5’PCR Primer、2 μl CDS/3’Primer、2 μl 50×Advantage Klen Taq Polymer ase Mix合成第二链。在第二链合成时，cDNA∶RNA杂交链上的RNA经Rnase H酶解，在DNA Po lymerase的催化下将RNA置换成DNA。取5 μl作电泳确定双链cDNA的大小，其余经末端补平 、加衔接头、磷酸化，过cDNA size fractionation column以去除分子量小于400 bp的cDNA 片段。
1.5 cDNA的克隆与鉴定
将75 ng的cDNA与500 ng的λTripleX Arms连接，按Boehringer Mannheim公司的DNA Pacji ng kit包装噬菌体，并以XL-l blue作受体菌滴定文库的滴度和重组率，并扩增文库。取1 μl扩增库作模板，用5组已知的牙本质和釉质基质蛋白基因(DSP，DMP1，Amelogenin,Amelo blastin,Tuftelin)引物进行PCR初步鉴定文库。2 结 果
2.1 小鼠牙胚总RNA和mRNA的提取(图1)
图1 提取的小鼠牙胚总 图2 LD PCR扩增的小鼠牙胚
RNA和mRNA 带1.总 cDNA 带1.cDNA:分子量介于
RNA:28S:18S为1.5左右。 0.5～4 kb之间的拖带，其中
带2.mRNA：分子量介于0.5 可见明显条带。带2.Marker:
～8 kb之间的拖带。 λDNA经Pst1酶切。抽提的总RNA无明显降解，mRNA在介于0.5～8 kb之间有拖带。
2.2 LD PCR扩增小鼠牙胚cDNA(图2)
LD PCR产物介于0.5～4 kb之间，其中可见明显条带。双链cDNA经过分段分离后小片段cDNA 被去除掉。
2.3 滴定未扩增库和重组克隆的百分比(图3)