小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆和部分序列分析
目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白(DSP)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠DSP成熟区的基因片段(约1.4 kbp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-DSP的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠DSP成熟肽编码区基因，正在进行该基因的表达和活性鉴定。
关键词 牙本质基质蛋白；涎蛋白；聚合酶链反应；小鼠
牙本质涎蛋白(Dentin Sialoprotein, DSP)是牙本质基质蛋白中的特异性蛋白之一，在牙本质形成和生物矿化方面发挥着重要的调节作用。因与骨涎蛋白的氨基酸组成相似而得名［1］。DSP是Butler等［2］于1981年首次分离纯化的一种牙本质非胶原蛋白(Dentin Non-Collageous Proteins, DNCPs)，1994年Ritchie等［3］克隆了大鼠DSP cDNA片段。本组采用逆转录PCR方法(RT-PCR)，从新生昆明小鼠磨牙牙胚组织中克隆到DSP成熟区基因片段，并测定了其部分核苷酸序列，为表达有活性的DSP蛋白奠定基础。
1 材料和方法
1.1 小鼠磨牙牙胚的来源和获取
本实验所用5～10d龄的新生昆明小鼠(B6D2F1)来源于中科院上海细胞生物学研究所动物房。将新生小鼠拉颈处死，断头，暴露磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取处于牙本质形成期的小鼠第一、二磨牙［4，5］，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
1.2 总RNA的提取
磨碎冻存的小鼠磨牙牙胚组织，在盛有预冷的变性缓冲液(德国宝灵曼公司)的匀浆器中充分破碎组织细胞，组织与缓冲液的比例为1:10。用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA，并进行电泳鉴定。
1.3 cDNA的合成和PCR扩增
根据Ritchie等［3］和MacDougall等［6］报道的大鼠DSP和小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。为了获得完整的小鼠DSP成熟区基因，将5\和3\端引物向两侧延伸100多碱基，5\引物碱基序列为：5\AAGAATTCTCAGCCTGGAAAGGGAGATAAGG3\带有EcoRI酶切位点；3\端的引物序列为5\AAGGATCCGTCATCGAACTCGTAACTGTCATGC3\，带有BamHI酶切识别序列。用Gibco BRL公司的Super Script TM试剂盒，按其说明进行逆转录（RT），合成cDNA第一链，以其为模板，PCR扩增出小鼠DSP成熟区基因片段(美国MJ Research公司 PTC-150型PCR仪）。Taq Plus Ⅱ DNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司。
1.4 PCR产物的克隆及酶谱分析
PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳回收，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段(Promega公司)对PCR产物进行部分补平，对载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌XL1-Blue，蓝白斑筛选阳性克隆pBS/DSP。碱裂解法快速提取pBS-DSP质粒DNA，用EcoRI、BamHI双酶切和PCR鉴定目的基因是否插入载体质粒中。
1.5 核苷酸序列分析
将挑取的pBS-DSP克隆培养扩增，用碱裂解沉淀法抽提质粒DNA，用T7 promotor引物，采用Sanger双脱氧终止法，用α-35S-dATP标记进行部分序列测定。
2 结果
2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳(图1)，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
1.小鼠牙乳头组织总RNA
2.小鼠纹状体总RNA图1 小鼠牙胚组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.4kbp的特异扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物DSP和重组质粒pBS-DSP
酶切图谱琼脂糖凝胶电泳1.λDNA-HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)