小鼠氟牙症分级标准的建立
【摘要】 目的 建立小鼠氟牙症分级标准。方法 将雄性ICR小鼠48只随机分为4组，分别饮用含质量分数0、55、110和220 mg/L氟化钠的双蒸水，实验为期42 d。每天用数码相机记录并观察小鼠下切牙釉质的改变。偏振光下观察氟牙症小鼠下切牙釉质的矿化程度。结果 小鼠切牙釉质发生了透明度、混浊、白色条纹、白垩色斑和缺损等不同程度的变化，偏振光下可见实验组釉质内不同程度的低密度褐色矿化不全区，小鼠氟牙症被分为11级。结论 建立了小鼠氟牙症11级分级标准。
【关键词】 氟化钠； 氟牙症； 分级标准
氟牙症是机体氟中毒的早期体征，是目前评价地方性氟中毒的主要指标之一。由于小鼠切牙成釉器的发育过程与人类牙齿的发育过程相似，故成为牙齿发育研究和牙齿生物矿化研究非常理想的动物模型，在氟牙症发病机制和预防研究中得以广泛应用。迄今小鼠氟牙症的观察指标尚不明确，也无公认的分级评价标准。故本研究通过给予小鼠不同质量浓度的氟化钠饮水，观察切牙釉质的改变，根据其变化，客观地评价小鼠氟牙症病变程度，并建立其分级标准，为小鼠氟牙症防治效果的评价提供参考。
1 材料和方法
1.1 研究对象的选择和分组
氟牙症动物模型的建立参照章魁华等[1]描述的方法。将48只体重为20～22 g的雄性ICR（in-stitute of cancer research，ICR）小鼠随机分为A、B、C、D组，每组12只。通过预实验确定，A、B、C组小鼠分别饮用质量浓度为55、110和220 mg/L的氟化钠双蒸水，造成不同程度的氟牙症表现；D组为对照，仅饮用双蒸水。所有小鼠的饲养条件一致，按组分笼饲养，自由饮水摄食，饲养42 d。
1.2 观察指标
每天用数码相机在自然光下拍摄小鼠切牙，观察小鼠切牙釉质颜色、透明度及其形态改变。以小鼠下切牙近龈缘区棕黄色消退作为判断小鼠氟牙症开始形成的依据。
1.3 组织学观察
饲养42 d时断颈处死小鼠，解剖分离下切牙，置于质量分数为4%的多聚甲醛中固定，－4 ℃冰箱保存作硬组织切片观察。将不同病变程度的小鼠下颌切牙固定、浸润、包埋、聚合后切片，用3∶1的甘油封片，偏振光下观察釉质的矿化改变。
1.4 统计学分析
数据分析采用SPSS 12.0统计软件，检验水准α＝0.05。
2 结果
2.1 各组小鼠不同时间段氟牙症的发生和分级情况
各组小鼠不同时间段氟牙症的发生情况见表1。小鼠下切牙氟牙症分级见图1。
2.2 实验组小鼠下切牙氟牙症的表现情况
对照组小鼠切牙釉质呈半透明棕黄色，光滑而有光泽（图1A）。实验组小鼠切牙随摄氟时间和摄氟量的增加，从近龈缘区向切端，釉质透明度、光泽、釉面形态、牙齿形态和颜色均发生规律性的变化，其中以下切牙的变化最为丰富。
2.2.1 釉质透明度 A组釉质透明度逐渐增高，出现透明条带（图1B），继而透明条带融合，伴随牙齿棕黄色的逐渐褪去，呈白色玉石样外观（图1C），以切端1/3最为典型。B、C组的釉质透明度在出现短暂增高后随即下降，相继出现轻度浑浊、白色条纹或斑点（图1D、E），随后条纹逐渐扩大融合形成白色斑块，牙齿半透明区域逐渐消失（图1F）。
2.2.2 牙齿光泽 伴随釉质透明度的增高，牙齿表面光泽增强，随白色斑块的出现，光泽逐渐消失（图1G），呈无光泽的白垩色或粉笔样改变（图1H、I）。
2.2.3 釉面形态 随白色斑块的出现，釉面形态相继出现粗糙、点状缺损、表层缺损和剥蚀样外观（图1J）。
2.2.4 牙齿形态 初起牙齿外形无明显改变。上牙逐渐伸长，下牙逐渐变短，继而下切牙切端变平，磨损明显，最后露髓（图1K）。
2.2.5 牙齿颜色 切牙唇面观察显示，初期牙齿的棕黄色逐渐褪去，相继出现一过性的着色不均、白色半透明、白垩色，而白垩色表面可有色素沉着。
依据小鼠切牙的上述变化，将小鼠下切牙病变划分为11级（表2），根据小鼠切牙釉质的透明度、混浊、白色条纹、白垩色斑、缺损等不同程度的变化，将1～3级定为极轻度氟牙症，4～5级定为轻度氟牙症，6～8级定为中度氟牙症，9～10级定为重度氟牙症。
2.3 小鼠下切牙硬组织切片偏光显微镜观察结果
正常小鼠切牙釉质表层和表层下矿化良好，表层为负双折射。极轻度氟牙症可见釉质表层光滑平整，釉质生长线和横纹清晰，仅在表层下可见少许模糊不清的褐色区域，为釉质表面的浑浊矿化不良区。轻度氟牙症可见釉质和釉质-牙本质界处的钙化不全区为牙面横纹的白色不透明区，矿化差的区域为牙面横纹处，釉质表层可见褐色的矿化不全区与矿化正常的区域。中度氟牙症整个釉质都为白垩色，表层为密度较低的褐色矿化不全区。重度氟牙症釉质表面有缺陷，可见釉质表层连续性中断，牙本质内也可见呈正双折射的矿化缺陷区。
2.4 实验小鼠患氟牙症程度的分级情况
实验结束时，各实验组小鼠患氟牙症程度的分级情况见表3。
3 讨论
在毒理学研究中，小鼠以其来源广、繁殖快和遗传背景相对清楚而备受推崇。在研究氟化物对人类牙齿的作用时，往往选用小鼠作为实验对象。ICR小鼠适应性强、体格健壮、繁殖力强、生长速度快、实验重复性较好，是国际通用的封闭群小鼠，广泛用于药理、毒理等的研究。本研究给予ICR小鼠不同质量浓度的氟化钠饮水，造成不同程度的氟牙症，其典型表现与以往研究结果一致，说明本研究氟牙症动物实验模型的建立是成功的[2-3]。
氟牙症是牙齿在形成矿化过程中，机体持续摄取过多的氟而造成的釉质矿化和发育异常，釉质出现微孔，症状随着氟牙症的中毒程度而加重。表现为牙面粗糙，呈白垩色斑点、斑纹或斑块，严重时形成局灶性的釉质缺损。如有色素沉着，则有着色表现。除上述变化外，本研究对小鼠切牙在釉质透明度、光泽、釉面形态、牙齿形态、颜色等方面发生的动态变化进行了描述，其典型的病变过程依次为釉质色素消失（透明度增高）、釉质浑浊、牙表面缺损、牙齿磨损。正常小鼠切牙唇面因有成釉细胞分泌的色素而呈棕褐色，但受氟的影响，成釉细胞功能受损，分泌的色素逐渐消失。如果此时釉质的矿化未受到抑制，则表现为牙齿透明度的增加（图1C）。
当过量的氟使成釉细胞发生功能障碍时，将导致釉质矿化缺陷。在本研究中，小鼠釉质的混浊或表面白色不透明区即为钙化不全区[4-5]。轻度的矿化不全表现为白色条纹和斑点，偏光显微镜下，其光学性质随递质的折射率和孔隙的体积不同而改变呈正双折射。在本研究硬组织切片中，釉质的褐色矿化不全区域即为小鼠氟斑牙表面的白色条带。随釉质内孔隙的增加，矿化度进一步下降，釉质呈白垩色改变，如有色素沉着可再度出现不均匀着色。矿化度的进一步下降，导致釉质表面形成缺损。
实验动物氟牙症的评价目前尚无明确、公认的标准，因此，难以对氟牙症防治效果进行客观准确地评价。李达圣等[6]对大鼠氟牙症按照牙面棕色条纹的数量和白垩色改变进行了5级分类（正常为1级）。结合本研究结果笔者认为，小鼠氟牙症的改变涉及釉质透明度、光泽、釉面形态、牙齿形态和颜色等多项改变，仅以条纹和白垩色斑为分级指标较为简单局限，无法涵盖小鼠氟牙症的所有临床表现。本研究通过每天观察每只小鼠切牙在釉质透明度、光泽、釉面形态、牙齿形态和颜色等方面发生的动态变化建立的小鼠氟牙症11级分级标准，能够较为全面、精细地描述氟牙症的变化。李达圣等[6]的5级分类方法与本研究提出的11级分类法中的5～8级重合，适用于中度病变，当前者用于氟牙症预防效果评价时，可能会导致不同程度的偏倚。为了便于分级标准的使用，在新建分级标准中对白色斑块分布的位置、大小和白色条纹的宽窄均进行了描述。
本研究分级标准以氟中毒时小鼠釉质病变程度为基础，根据釉质发生的透明度、混浊、白色条纹、白垩色斑和缺损等不同程度的变化，分级细化清楚、客观指标明确、易于掌握和使用，为氟牙症预防效果的客观评价提供了参考资料。