小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

　　摘要　　目的：克隆小鼠成釉蛋白(AMBN)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段(约1.1 kbp)，将所得基因片段插入pTZ18质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pTZ-AMBN的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠成釉蛋白成熟肽编码区基因。

  　发育中的釉质矿化程度相对较低，基质富含蛋白质和水，蛋白含量高达25%～30%。釉质基质蛋白分成两大类：疏水的釉原蛋白（amelogenin）和非釉原蛋白（non-amelogenin）。成釉蛋白是非釉原蛋白的新成员，其cDNA序列不久前刚刚公布［1］，该蛋白含量在发育釉质基质中仅次于釉原蛋白，但有关成釉蛋白在体内的生物学功能尚不清楚。本文采用逆转录PCR技术克隆小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA，为表达该蛋白和研究其生物学效应打下基础。

1　材料和方法

　　用于扩增小鼠成釉蛋白成熟区基因的两条PCR引物为： 5\端引物碱基序列为：5\ TGGTTGCACGGACTTCTCCC 3\；3\端的引物序列为5\TAGTGCTCTTAACACCTTCACTGCG3\。载体质粒pTZ18(pTZ)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆pTZ-AMBN。

　　小鼠磨牙牙胚总RNA的提取、逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸序列分析与郝建军等的报道相同［2］。

2　结果

2.1　新生小鼠磨牙牙胚总RNA

　　提取的新生小鼠磨牙牙胚总RNA电泳［2］，获得的总RNA无明显的降解。

2.2　RT-PCR

　　牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.1 kbp的特异扩增产物(附图)。

2.3　pBS-AMBN克隆的酶谱分析（附图）

　　附图　PCR扩增产物AMBN和重组质粒pTZ-AMBN酶切图谱琼脂糖凝胶电泳

　　1.λDNA-PstI

　　2.阴性产物(未加模板)

　　3.以重组质粒为模板的AMBN PCR产物

　　4.重组质粒pTZ-AMBN经BamHI和SacI双酶切

　　5.载体质粒pTZ

　　6.重组质粒pTZ-AMBN

　　7.阴性对照

　　8.目的产物AMBN

　　9.λDNA-PstI

　　重组质粒pTZ-AMBN经BamHI和SacI双酶切后为两条带(附图，第4道)，1.1 kbp的成釉蛋白基因PCR产物和2.86kbp的载体pTZ。1.1kbp的成釉蛋白与 PCR的目的产物电泳条带(3,8道)平齐，2.86kbp的pTZ与空载体pTZ(5道)平齐。重组质粒pTZ-AMBN经SmaI酶切后的图谱与预期的完全一致。

2.4　pBS-AMBN克隆的序列分析

　　成釉蛋白成熟肽编码区基因部分核苷酸的测序结果，可读出的200多个碱基序列与基因库报道的结果完全相同。

3　讨论

　　1996年Krebsbach等［3］从大鼠未矿化部分牙齿cDNA文库中筛选到了一个牙齿特异性基因，全长1929个碱基，编码422个氨基酸，相对分子量(Mr)为45×103，富含脯氨酸、亮氨酸，将该基因在大肠杆菌中表达，获得的蛋白免疫兔子获取多抗，免疫组化和原位杂交证实在内釉上皮细胞向成釉细胞分化过程中表达成釉蛋白，定位于分泌性成釉细胞的Tome 氏突起，此外他们还发现成釉蛋白定位于人类4号染色体上。Backman等［4］发现常染色体显性釉质发育不全的增生不良型（AIH2）染色体座位在4q，因此成釉蛋白为AIH2的重要候选基因之一。

　　目前认为成釉蛋白控制晶体生长速度和维持晶体生长，决定釉柱结构，加之又是部分遗传性釉质发育不全疾病的重要候选基因，关于成釉蛋白基因及其功能的研究有着重要的意义。本组根据已报道的小鼠成釉蛋白cDNA序列设计PCR引物，通过逆转录PCR从新生的小鼠牙胚总RNA中扩增出了1.1 kbp大小的特异片段，经过克隆后，对重组的质粒进行酶切和部分序列分析，证实已克隆了小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA片段。目前正在原核系统中表达该片段。