人牙龈成纤维细胞系的建立及其生物学特性
摘要目的: 建立人牙龈成纤维细胞系并观察其生物学特性。方法: 用组织块法培养细胞, 用形态学、免疫组化染色、染色体分析等方法鉴定细胞, 通过活细胞观察、生长曲线测定及MTT比色实验研究细胞体外生长特性。结果: 20 例原代培养, 成活率90%。培养细胞呈梭形, 胞浆波形丝蛋白阳性, 能合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及纤维粘连蛋白, 具有正常二倍体核型, 体外贴壁快, 生长迅速, 细胞寿命为(250.7±113.3)d。结论:
本实验建立的细胞系符合人牙龈正常二倍体成纤维细胞系。
牙龈成纤维细胞是牙龈结缔组织中主要的间质细胞, 担负着合成细胞外基质的功能, 如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白(Fn)等, 在许多生理和病理过程中起着重要作用。近年来, 许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模型, 在牙周组织疾病的发病机制及治疗方面进行了有益的探索［1～3］，但对人牙龈成纤维细胞的生物学特性的报道尚不多。本文报道人牙龈成纤维细胞(huam gingival fibroblast, HGF)系的建立及其生物学特性。
1 材料和方法
1.1 取材及细胞培养
无菌收集20例因正畸或阻生拔除的正常牙齿, 切取少量牙龈组织, 按组织块贴壁法,用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 在37℃、50ml/L CO2和饱和湿度条件下培养。
1.2 形态观察
用倒置显微镜观察。
1.3 免疫组织化学染色
应用9种抗体染色：①鼠抗人波形丝蛋白抗体43βE; ②鼠抗人角蛋白抗体34βE12; ③鼠抗人胶质蛋白抗体GFA8; ④鼠抗人神经原蛋白抗体31γA11; ⑤鼠抗人结蛋白抗体; ⑥兔抗人第Ⅷ凝血因子抗体; ⑦兔抗人Ⅰ型胶原抗体; ⑧兔抗人Ⅲ型胶原抗体; ⑨兔抗人Fn抗体。①～⑥由美国华盛顿大学医院病理科提供; ⑦和⑧由第四军医大学病理教研室提供; ⑨为上海生物制品研究所产品。小鼠抗体用美国Vector公司ABC试剂盒染色,兔抗体用军事医学科学院PAP试剂盒染色。
1.4 核型检测
常规空气干燥法。
1.5 支原体检查
常规地依红染色法。
1.6 细胞冻存与复苏
按常规方法进行。
1.7 细胞贴壁观察
倒置显微镜下观察活细胞的贴壁过程, 并用计数法测定细胞贴壁率。
1.8 细胞生长测定
光镜下计数HE染色细胞核分裂指数; 用计数法测定不同接种密度时的细胞生长曲线; 用MTT比色法测定不同血清浓度对细胞生长的影响。
2 结果
2.1 HGF原代培养的特点
20例原代培养成活率为90%。培养第4～7天, 少数梭形细胞从组织块边缘长出并逐渐形成细胞晕。原代细胞生长平均18.4d后即可汇合成致密单层细胞。
2.2 形态特征
HGF呈梭形或星形, 胞浆突2～4个, 胞浆丰满; 细胞核为1个, 呈椭园或园形。细胞密度较低时细胞交织成网状, 密度较高时细胞排列成束状或旋涡状（图1）。
图1 体外培养的HGF (40×）
2.3 免疫组化染色结果
HGF对波形丝蛋白抗体、Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体及Fn 抗体呈阳性反应, 对其它6种抗体呈阴性反应, 说明HGF含有间质细胞特有的波形丝蛋白并具备成纤维细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及Fn的功能，其结果与标准参照细胞系2BS的染色结果一致。
2.4 细胞核型特点
HGF染色体众数为46, 频数大于75%, 未见染色体结构异常, 符合人正常二倍体细胞系的特征。
2.5 支原体染色结果
HGF中支原体荧光染色阴性。
2.6 冻存与复苏后的细胞活力
HGF冻存1年以上再复苏, 活细胞数>85%。
2.7 细胞贴壁特性
HGF在传代后15～30min, 大约有半数细胞贴壁, 少数细胞开始铺展, 呈煎鸡蛋样; 1h后, 细胞贴壁率达87.5%, 部分细胞呈短梭形; 4h后, 细胞贴壁率为97.1%, 细胞完全铺展, 呈梭形或星形; 24h时, 细胞交织成网状。
2.8 细胞生长特点
细胞在传代后第1天生长较缓慢; 从第2天开始细胞分裂增殖活跃, 呈对数生长, 一般在第2～3天细胞分裂指数达高峰, 平均峰值为24.8‰, 细胞群体倍增时间为(50.9±5.1)h; 当细胞达到饱和密度时, 细胞生长趋于停滞状态, 细胞生长曲线呈“滞缓-对数生长-平台”模式(图2)。细胞平均传代时间为3.94d。培养液中的血清浓度对HGF生长有一定的影响, 当血清浓度低于10%时, 细胞生长缓慢(图3）