成人牙周炎治疗前后龈沟液蛋白质的电泳分析

　　【摘要】　目的　通过分析成人牙周炎患者同一位点基础治疗前后1个月龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中蛋白成分的改变，以期发现能够反映牙周健康及疾病状况的特异蛋白。方法　采用滤纸条法收集12例成人牙周炎患者56个位点GCF样本，以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离，Image MasterTM电泳 图象分析仪分析其中的蛋白质。结果　治疗后蛋白区带数及非血清源低分子量12 000，10 000蛋白的丰度及百分含量较治疗前显著减少(分别为P＜0.001和P＜0.05)，而38 000蛋白百分含量呈增加趋势且与治疗前牙周探诊深度和GCF量呈负相关(P＜0.05)。结论　分子量为12 000，10 000的蛋白与牙周炎症有关；分子量38 000的蛋白与疾病的好转有关。

　　【关键词】　龈沟液　　蛋白质　　电泳　　成人牙周炎

　　龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中的非血清源蛋白与牙周疾病的关系较密切［1，2］，但是关于牙周治疗对GCF中蛋白成分的影响及各蛋白成分与临床指标之间的关系尚未见明确报道。本研究对12例成人牙周炎患者，基础治疗前后GCF中蛋白质成分的变化进行了短期纵向观察，并对其与临床指标间的相互关系和变化规律进行了分析。

材料与方法

　　1.病例选择：按Page和Schroeder［3］所述标准，从北京医科大学口腔医学院牙周科初诊患者中选择12例成人牙周炎(AP)患者(男7名，女5名)，年龄26～60岁(平均49.5岁)。所有受检者均符合以下条件：至少半年未进行牙周治疗或使用抗生素；妇女未妊娠；全身健康，无系统疾病。所取位点为牙周探诊深度(PD)3～9mm、附着丧失(AL)1.5～11.5mm的邻面位点，共计56个，平均4～6个位点/人。

　　2.临床检查项目：菌斑指数(PLI)、出血指数(BI)、牙周探诊深度及附着丧失。所有患者的检查及治疗均由同一人完成。

　　3.GCF的收集：治疗前及经牙周基础治疗(包括口腔卫生宣教、洁治、深刮及根面平整)后1个月，在同一患者的同一位点用2×10mm Whatman 3M滤纸条沟内法重复取30秒GCF样本(若滤纸条带血，则弃之不要，换牙位再取)。所取样本及前臂静脉血血清置于-70℃低温冰箱保存。

　　4.GCF量的测定：分别称出取样前后滤纸条的重量(AE240电子天平，METTLER，Sweden)，二者之差为所收集的GCF量。

　　5.GCF蛋白含量的测定：采用染料结合比色法。滤纸条解冻后，Tris-HCl缓冲液反复2次振荡离心洗提滤纸条上的龈沟液。以小牛血清白蛋白(BSA)为标准，考马斯亮蓝G-250染色，450型微板读数仪(Bio-Rad 595nm)检测，计算出每份样本中的蛋白含量。

　　6.GCF样本的制备和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：电泳前先将GCF洗提液及血清样本干燥后再用2%SDS样本缓冲液溶解，使蛋白浓度达1g/L，加热5分钟(100℃)。采用12.5%丙烯酰胺/双丙烯酰胺均质胶，加样0.3μl，在微量自动快速电泳仪上进行电泳，条件为250V、10.0mA、3.0W、15℃、70avh。同一部位治疗前后的GCF样本及同一患者血清、标准蛋白加样在同一块胶上，标准蛋白的分子量为94 000、67 000、43 000、30 000和17 500。凝胶染色根据周爱民和杨开宇［4］的银染色方法进行改进。

　　7.凝胶分析：用Image MasterTM电泳图像扫描仪测定各样本区带蛋白质亚基的分子量，并对各带进行丰度、百分含量的定量分析。

　　丰度=某分子量蛋白质区带的吸光度值(A)×该区带面积(mm)，反映该分子量蛋白质的含量。

　　百分含量=(某分子量蛋白质的丰度/该泳道所有分子量蛋白质的丰度之和)×100%，反映某分子量蛋白占该位点GCF中所有蛋白含量的百分比。

结果

　　所有检测位点经牙周基础治疗后，各临床指标的数值明显下降(P＜0.001)，GCF量及其蛋白含量均显著减少(P＜0.001)，蛋白浓度虽然升高，但与治疗前差异无显著性［5］。

　　SDS-PAGE分析显示，同一位点治疗前后GCF的蛋白质区带数、蛋白分子量和各分子量蛋白质的含量(由丰度表示)不完全相同。治疗前蛋白质平均区带数为7.60条(SD=1.69)；治疗后明显减少至6.59条(SD=1.99)，差异有非常显著性(P＜0.001)。