成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞群及克隆钙化的作用
【摘要】 目的 观察碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对牙周膜(periodontal ligament, PDL)细胞克隆体外钙化的作用。方法 对3颗前磨牙的牙周膜细胞进行细胞克隆化，观察bFGF对PDL细胞克隆钙化能力的影响，测定细胞牙骨质附着蛋白(cementum-derived attachment protein,CAP)的结合力及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的表达。结果 bFGF使PDL细胞克隆钙化率增加了11%。bFGF依赖性钙化克隆与非bFGF依赖性钙化克隆相比具有较低的ALP表达率和较高的CAP结合力。结论 bFGF可在体外促进PDL细胞克隆钙化的形成，bFGF依赖与非依赖性钙化克隆是不同的细胞种群。
【关键词】 牙周膜细胞 成纤维细胞生长因子，碱性 钙化 克隆细胞牙周膜(periodontal ligament, PDL)中具有再生能力的细胞的减少是影响牙周组织再生的主要因素之一。增强PDL细胞中具有再生能力和潜力的细胞的分化与增殖，是牙周组织再生的关键之一。我们利用细胞克隆的方法，结合细胞的牙骨质附着蛋白(cementum-derived attachment protein, CAP)的结合及碱性磷酸酶(alkaline phsphatase,ALP)的表达，观察碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对PDL细胞群及其克隆细胞的钙化能力表达的作用，以揭示生物因子应用的规律和方式。
材料与方法
1.材料：PDL分别取自3名男性(22～24岁)因正畸而拔除的3颗正常前磨牙。
2.方法：
(1)牙周膜细胞克隆化：将3颗正常前磨牙的PDL进行原代培养，用稀释法进行细胞克隆化［1］。培养液为α-MEM，含15%小牛血清及抗生素(青霉素、链霉素及二性霉素)。细胞扩传并进行以下实验。
(2)克隆细胞ALP的表达：取24孔组织培养板，每克隆2孔，细胞接种浓度为2 000个/孔。标准条件下培养24 h后，按以往的ALP染色方法进行［1］。光镜下观察，计算每克隆细胞的ALP阳性率。
(3)克隆细胞CAP的结合能力：CAP(美国华盛顿州立大学医学院提供)的125I标记采用氯胺T(chlormine-T)方法［2］。96孔组织培养板，每克隆组4孔，每孔接种细胞1×1010个，测定方法同作者以往的方法［2］。测定数值单位为脉冲数/分钟(cpm)。将总cpm值减去非特异性cpm值，即为该细胞克隆的特异性CAP结合的cpm值。
(4)克隆细胞体外钙化能力的表达［1］：96孔培养板，每克隆6孔，细胞接种浓度为5×103个/孔，24 h后用含有15% FCS、10 mmol/L的β-磷酸甘油、10-8mol/L的实验用氟美松(Sigma Chamical Co., St. Louis, MO)及50 g/L的抗坏血酸的α-MEM进行培养，其中3孔加入3 μg/L bFGF(以色列特拉维夫大学医学院眼科研究所提供)，另外3孔不加bFGF。第28天终止培养，饱和茜红素溶液(pH=4.0)染色并进行肉眼和相差显微镜观察。以上每项指标均以该克隆细胞的父代多克隆细胞为对照组。结果
1.PDL细胞的克隆率：本组细胞标本分别来自3个不同的个体，共观察到211个克隆细胞，获得生长的克隆细胞为89个，占克隆细胞数的42%。
2.克隆细胞钙化能力的表达：图1显示，在无bFGF作用下钙化的细胞克隆(简称非bFGF依赖性钙化克隆)表达率为42%，而应用bFGF作用的组中，钙化克隆细胞的表达率比前增加了11%。该结果提示有11%的克隆细胞仅在bFGF的作用下才具有体外钙化的能力(简称bFGF依赖性钙化克隆)(图2)。这两种不同条件下的钙化经配对t检验差异有显著性(P<0.05)，但二者均为弥散状钙化，在形态上无明显差异(图3)。所有的父代多克隆细胞无论是否有bFGF的作用均无钙化样组织形成。
3.克隆细胞的ALP表达率及CAP结合力：①bFGF依赖性钙化克隆的ALP表达率平均为39.0%
图1 碱基成纤维细胞生长因子对牙周膜克隆细胞体外钙化表达的影响±2.3%，而非bFGF依赖性钙化克隆为78.0%±4.5%，后者极显著高于前者(P<0.01)。②bFGF依赖性钙化克隆的特异性CAP的cpm平均值为2.70±0.11，而非bFGF依赖性钙化克隆的平均值为2.10±0.16，后者显著低于前者(P<0.05)。
