抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体抗粘附作用机制的研究

　　【摘要】　目的　探讨Ⅰ型菌毛粘附机理和抗Ⅰ型菌 毛单克隆抗体抗粘附作用。方法　应用提取的抗粘放菌Ⅰ型菌毛单克 隆抗体，采用3H标记法，在体外测定细菌对SHA的粘附率及抗体的粘附抑制率。结果　抗粘放菌Ⅰ型菌毛单抗抑制细菌对SHA的粘附达80%，与多克隆抗体无显 著差异。结论　Ⅰ型菌毛主要介导粘放菌对SHA的粘附，抗Ⅰ型菌毛 抗体可以有效地阻抑细菌的粘附。

　　【关键词】　粘放菌Ⅰ型菌毛　　粘附　　单克隆抗体

　　现已知粘性放线菌借助Ⅰ型菌毛粘附牙面，形成菌斑是其致病的第 一步，为此，许多学者都在致力于研究如何阻断细菌对牙面的粘附，从而防止龋病的发生。 我们在研究粘性放线菌5519Ⅰ型菌毛的基础上，得到了纯化的菌毛蛋白质，其分子量为54KD 和38KD，而且进一步研究发现二者属于同一功能单位，并取得了抗Ⅰ型菌毛的单克隆抗体和 多克隆抗体。在此基础上，拟打算利用Ⅰ型菌毛的单克隆抗体和多克隆抗体在体外进行抗粘 附实验研究，为进一步探讨粘放菌Ⅰ型菌毛的粘附作用机制提供理论依据。

材料和方法

　　1.抗粘放菌5519Ⅰ型菌毛单克隆抗体的提取和制备［1］。

　　2.抗粘放菌5519Ⅰ型菌毛多克隆抗体的提取和制备［2］。

　　将上述抗粘放菌5519Ⅰ型菌毛的单克隆抗体和多克隆抗体以无菌蒸馏水按原倍、1：2、1：4 、1：8、1：16、1：32不同浓度稀释备用。

　　3.细菌培养及同位素标记：将经生化鉴定的粘放菌5519(只含Ⅰ型菌毛)，5951(只含Ⅱ型菌 毛)的细菌于对数生长期转种于TSB液体内，分装7支试管，其中6支加入H3胸腺嘧啶核苷(7 μ ci/ml)，然后一起微需氧培养24小时，取出培养菌液，离心收集菌细胞，用pH6.8， 0.05M磷酸钾缓冲液洗涤细胞三次，以去除未与细胞结合的放射性培养残液。在未标记 的细胞中加入pH6.8、0.05M磷酸钾缓冲液，在OD540nm中比色，使细菌浓度达0.8 ～1.0，根据此数值在标记H3的菌细胞液中加入5mg/ml牛血清白蛋白的磷酸钾缓冲液 ，使菌体浓度达OD 1.0悬浮于缓冲液中［3］。

　　4.粘附抑制试验：称取16mgHA，磷酸钾缓冲液浸泡过夜，吸干。实验组和阳性对照组分别加 入全唾液200μl，空白对照组加入磷酸钾缓冲液200μl，室温下旋转1小时形成唾液膜包被H A，磷酸钾缓冲液洗涤2次，每孔加入200ml含5mg/ml牛血清白蛋白的磷酸钾缓冲液，旋转1小 时，以封闭唾液未覆盖的HA表面，洗涤后加入菌液100μl和抗体100μl。阳性对照组为菌液 100μl和磷酸钾缓冲液100μl旋转1小时，洗涤3次，吸干。加入100μl闪烁液，闪烁计数， 并计算粘附抑制率［4］。

结　　果

表1　抗粘放菌Ⅰ型菌毛单抗对粘放菌粘附抑制率的比较(%)

 原倍1：21：41：81：161：325519(1+2-)

83.9

78.49

79.2

86.1

78.4

79.9

5951(1-2+)51.2550.3648.1130.25 26.2313.47t7.426.911.3514.4345.4945.75p＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

　　从表1中可以发现抗粘放菌Ⅰ型菌毛单克隆抗体对粘放菌5519具有明显的 粘附抑制能力，与粘放菌5951相比，在统计学上有极显著差异(P＜0.01)。

表2　抗粘放菌Ⅰ型菌毛多抗对粘放菌粘附抑制率的比较(%)

　　从表2中发现抗粘放菌Ⅰ型菌毛多克隆抗体同样对粘放菌5519有明显的粘附抑 制能力，与粘放菌5951相比，在统计学上有极显著差异(P＜0.01)

表3　抗粘放菌Ⅰ型菌毛单抗和多抗对粘放菌5519粘附抑制比较(%)