根管内感染控制对年轻恒牙牙髓再生治疗的影响及研究进展
牙髓再生治疗（regenerative endodontic procedure，REP）已普遍用于年轻恒牙的治疗。其在有效消毒根管系统后，以根尖区活性组织、干细胞和血凝块支架为基础，促进牙根继续发育、实现根尖孔闭合，干细胞的活性和生长因子的释放均会影响其预后。
长期随访发现REP疗效较好，但仍存在失败的可能，根管持续感染和再感染是失败的主要原因，已在REP失败的牙齿根管内发现有细菌残留，残留细菌及其生物膜会损伤干细胞，阻止牙髓组织的修复和再生。
此外，根管冲洗剂和根管药物的细胞毒性也会影响REP的预后。这些因素都与根管内感染控制相关。本文通过回顾相关文献，探讨根管内感染控制对REP预后的影响，并对感染控制的新兴前沿进展进行总结，介绍在根管感染控制领域具有应用前景的新方法。
1.年轻恒牙根管内感染控制的重要性
年轻恒牙根管感染具有其自身的特点。年轻恒牙的髓腔大、牙本质小管粗，其细菌浸润深度较成熟恒牙更深，侵及牙本质小管数量更多。在REP中，由于年轻恒牙根尖孔开放、牙根短小、根管壁薄等独特的解剖特点，在REP中不采用机械方式清除感染牙本质，主要通过根管冲洗和根管封药实现来控制感染。
REP的成功取决于感染控制的彻底与否和冠方封闭的严密与否，且根管持续感染和再感染是其失败的主要原因，因而根管感染控制对REP的成功至关重要。为了避免根管再感染的发生，在治疗过程中要预防外源性感染的发生。在治疗过程中需使用橡皮障，并对橡皮障边缘进行封闭，有效隔离唾液的污染。
此外，在治疗前需对患牙及邻牙牙冠表面，以及橡皮障布等进行彻底的消毒，以免在治疗时将外源环境的细菌引入根管内，导致外源性感染的发生。最后，在最终治疗完成后，要对牙冠进行严密的封闭，以防止微渗漏的发生导致再感染。
2.年轻恒牙根管内感染控制方法的现状
次氯酸钠（sodium hypochlorite，NaClO）、氯己定（chlorhexidine，CHX） 以及乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA） 是常用的根管冲洗药物，三联抗生素糊剂（triple antibioticpaste，TAP） 和氢氧化钙[Ca(OH)2]是常用的根管消毒药物，用于REP以控制感染。
NaClO具有杀菌和溶解有机基质的作用，浓度越高效果越好，但细胞毒性也随之增加，有学者认为足量、低浓度的NaClO冲洗也可以发挥良好的抗菌作用。CHX为阳离子表面活性剂，低浓度具有抑菌作用，高浓度具有杀菌作用；依赖其强渗透能力破坏细菌胞膜发挥作用，但无法溶解有机物和去除玷污层。
EDTA本身不具有杀菌效果，是一种金属阳离子螯合剂，17% EDTA溶液可作为根管冲洗液，能够与牙本质中的钙离子螯合，溶解无机基质，常与NaClO联合使用，提高去除玷污层的效果。TAP由甲硝唑、环丙沙星、米诺环素等比例组成，能够有效杀灭多种细菌，高浓度用药或封药时间过长会降低牙本质硬度，且米诺环素会导致牙冠变色，当前常使用不含米诺环素的二联抗生素糊剂（double antibiotic paste，DAP） 或改良TAP。Ca(OH)2是目前临床最常用的诊间抗菌消毒药物，其可在根管内形成强碱性环境，裂解细菌胞膜，灭活内毒素。
然而体内外研究表明这些物质单独或联合使用后，30%~50%的根管壁上仍残留浮游生物和生物膜，存在可培养的细菌，无法完全清除根管内细菌。在REP中，罹患根尖周炎的年轻恒牙经由1.25% NaClO根管冲洗和TAP根管封药进行处理后，根管内细菌检出率下降为30%。
临床研究中进行REP治疗的年轻恒牙，经由根管冲洗和根管封药后，根管内仍可检测到细菌的存在。临床上为了提高根管消毒效果，常辅以超声荡洗。临床随机对照试验发现：采用超声荡洗后根管内细菌数量与常规针头冲洗相比明显减少，但对内毒素的清除不具有显著差异，且二者处理后根管内的细菌种类组成基本相同。以上研究表明，当前年轻恒牙根管内感染控制方案尚无法根除根管系统中的细菌和生物膜。
3.感染控制方法对REP 的影响
3.1 根管内残留细菌对REP 的影响
3.1.1 残留细菌影响年轻恒牙牙根继续发育
根管内残留细菌会影响REP的预后。动物学实验研究了根管内残留细菌对根尖周组织愈合的影响，结果显示有细菌残留的根管，牙根明显发育不足，且形成的矿化相关组织显著减少。当根尖周病变持续存在时，根管壁厚度的增加显著减少。
临床研究也有类似的结果，de-Jesus-Soares等纳入15颗外伤年轻恒牙行REP，分别在治疗前、6%NaClO冲洗后以及根管内封药后取样并测定细菌含量，结果发现根管冲洗后细菌检出率仍高达100%，而封药后降至53.3%。随访发现，当根管内存在少量细菌时，根尖周病变仍可愈合，但会妨碍牙本质壁的增厚。以上结果表明，根管内残菌不利于年轻恒牙牙根的继续发育，是REP失败的风险因素之一。
3.1.2 残留细菌影响干细胞功能
残留细菌还会影响干细胞的功能。体外研究发现：当牙本质上有细菌残留时， 根尖乳头干细胞（stem cellsform apical papilla，SCAP） 中与牙本质形成相关的基因下调，而与成骨相关的基因上调；同时细菌抗原会显著抑制SCAP分化，说明细菌生物膜会影响SCAP的分化潜能，这可能与REP后常形成骨样组织，而鲜少形成牙本质有关。
当口腔链球菌和内氏放线菌2种细菌分别以浮游生物和生物膜形式对SCAP进行单一或混合感染时，其增殖、矿化和成牙本质分化能力均被显著抑制，其中以口腔链球菌的浮游生物形式或2种细菌双重感染形成的生物膜形式的作用最强烈，因而推测与单一菌种相比，残留多种细菌时其感染的联合效应可能对干细胞分化有更大的影响。
牙源性干细胞通过Toll样受体（toll-like receptor，TLR）的差异表达与局部炎症微环境相互作用，会促进免疫调节因子的分泌，调节干细胞的功能。此外，脂多糖、脂磷壁酸、细菌鞭毛蛋白、菌毛等作为TLR的配体，会激活多种TLR，进而影响干细胞的分化潜能。
已经证实在炎症微环境中细菌及其副产物以TLR依赖性的方式阻止SCAP的矿化，而当阻断TLR上游或下游关键分子后SCAP矿化能力得以恢复。但尚未明确各种TLR在牙源性干细胞中的具体作用机制，亟待进一步发掘。
3.1.3 残留细菌影响生长因子的释放
生长因子在REP 中发挥重要作用，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能够促进牙髓血管生成；转化生长因子β1 （transforminggrowth factor β，TGF-β1） 可促进干细胞的迁移和分化。然而，残余的细菌生物膜会影响生长因子的释放。
当内氏放线菌、具核梭杆菌和微小微单胞菌组成的多细菌生物膜黏附于牙本质壁后，进行根管消毒，结果发现壁上有细菌生物膜残留。同时，与无菌根段相比，生物膜残留组中TGF-β1的释放量显著降低，说明残留的细菌生物膜会影响生长因子释放。当前，关于残留细菌生物膜对生长因子释放的研究较少，值得进一步探索分析。
3.2 根管冲洗消毒药物的细胞毒性
3.2.1 根管冲洗剂的细胞毒性
根管冲洗剂具有细胞毒性。体外研究表明NaClO以浓度和时间依赖性的方式对牙源性干细胞产生细胞毒性，会影响干细胞在根管壁上的黏附能力。NaClO处理牙本质后， 牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC） 无法黏附于牙本质，当额外用Ca(OH)2和EDTA处理后DPSC的增殖和黏附增强，而NaClO处理后的牙本质经EDTA调理，可使干细胞的黏附和分化潜能部分恢复。
组织学上观察到EDTA预处理后，DPSC与牙本质表面形成紧密结合，并分化为成牙本质细胞样细胞；而NaClO处理后，则在牙本质界面观察到多核细胞形成的吸收陷窝，牙本质发生吸收破坏。目前，推荐在REP中用17% EDTA进行终末冲洗，以减小NaClO对牙源性干细胞活性的影响，但在使用EDTA后需要用生理盐水将残留EDTA冲洗干净，以免长时间作用导致牙本质硬度降低。
3.2.2 根管药物的细胞毒性
根管药物也具有细胞毒性，浓度梯度（0.01~100 mg·mL-1） 的抗生素糊剂以剂量依赖的方式显著降低SCAP的活力；而同样浓度的Ca(OH)2不会影响SCAP存活。由于根管药物对牙本质小管的渗透性，当其被冲洗干净后仍会对黏附于牙本质表面的干细胞产生间接效应。分别使用1 mg·mL-1和1 000 mg·mL-1 TAP及Ca(OH)2处理牙本质7 d和28 d后冲洗干净，加入SCAP，以模拟REP中SCAP从根尖区释放进入根管的情况，结果发现：1 000 mg·mL-1的抗生素处理后的牙本质上干细胞无法存活，而1 mg·mL-1的抗生素处理后对SCAP的存活无明显不利影响；但Ca(OH)2处理后可促进SCAP的增殖。
以上的研究表明，抗生素会影响干细胞的活性和干性，而Ca(OH)2对根尖区的活性组织无显著影响，但是Ca(OH)2作为根管药物，可能会在根尖区形成钙化屏障或导致根管钙化闭塞，从而不利于根尖区活性组织向根管内生长以促进牙根的继续发育。
4. REP 中感染控制的研究进展
4.1 新型根管冲洗剂
次氯酸钙[Ca(ClO)2]溶剂具有优越的组织溶解能力、化学稳定性和抗菌性能，其与TAP和Ca(OH)2相比，能够改善对粪肠球菌生物膜的消毒效果；Ca(ClO)2对细胞活力和矿化活性有不利影响，但其不利影响可以被10%的抗坏血酸中和。研究表明Ca(ClO)2的细胞毒性低于NaClO；经过Ca(ClO)2处理后的成纤维细胞具有良好的生存能力，同时其仅诱导机体低水平的炎症反应，说明Ca(ClO)2作为冲洗液具有可接受的细胞毒性和生物相容性。
N- 乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 是一种非抗生素化合物，具有抗菌和抗炎作用，其在口腔领域的应用潜力颇受关注。研究发现：NAC对多种细菌及其生物膜有效，包括粪肠球菌、内氏放线菌、变异链球菌等，且其抗菌作用优于2% CHX。NAC通过抑制核因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB） 信号通路来抑制促炎因子的分泌从而发挥抗炎作用。在脂多糖诱导的炎症反应条件下，NAC可以提高根尖乳头细胞的存活；当NAC与无机三氧化物聚合物（mineral trioxide aggregate，MTA） 联合使用时会提高人牙髓细胞存活率，并促进其矿化。因此，NAC在REP中具有良好的应用前景。
4.2 新型根管冲洗技术
为了提高根管冲洗的抗菌效能，研发了多种冲洗技术，除了临床上广泛使用的超声荡洗外，包括根尖负压冲洗技术（apical negative pressure irrigation）、光子诱导光声流技术（photon induced photoacoustic streaming， PIPS）、光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）等，其中根尖负压冲洗技术在REP中的应用已开展了相应研究。根尖负压冲洗技术通过在根管内形成负压来提高根管冲洗的效能。
通过构建年轻恒牙动物模型，比较了常规针头冲洗联合TAP封药与单一根尖负压冲洗两者之间的抗菌效果，处理后前者的细菌检出率降至21.72%，后者降至11.4%，可以看到单一根尖负压冲洗的抗菌效果更优。在组织学上，采用根尖负压冲洗能显著降低组织的炎症浸润程度，且能形成更多的矿化组织；同时干细胞中矿化相关分子的表达水平也升高。
4.3 新型抗菌支架
近年来，抗菌纳米纤维作为药物输送系统用以控制口腔感染得到了关注，能够针对浮游生物和生物膜有效抗菌控制感染，同时具有良好的生物相容性；其在REP中的应用潜力也得到了一定的研究。
纳米纤维支架负载甲硝唑、环丙沙星、米诺环素等抗生素后，能够缓释抗生素，有效抑制粪肠球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、内氏放线菌、金黄色葡萄球菌以及聚放线放线杆菌等常见的牙髓感染病原体生长及其生物膜形成。
研究表明，从纳米纤维收集的抗生素洗脱液对DPSC没有细胞毒性，因而认为抗生素缓释的支架可有效防止根管再感染，并有良好的生物相容性。Albuquerque等在此基础上设计研发了一种3D打印的管状TAP洗脱结构，并进行了相应的体内外研究，结果表明其具有优异的抗菌活性，可有效抑制牙本质小管内生物膜的形成；组织学研究结果表明，在REP中使用该3D打印的管状结构，能够实现根尖闭合并使得薄层的骨样牙本质组织长入根管内，同时该材料便于从根管内洗脱，可以减少抗菌药物在根管内残留以减小细胞毒性作用。
此外，与直接使用抗生素糊剂相比，负载抗生素的纳米支架处理后的牙本质表面，DPSC黏附、增殖和迁移能力增强。为了适应根管复杂的解剖形态，负载抗生素的水凝胶支架也应运而生，并在REP中显示出良好的应用前景，能够有效抑制粪肠球菌、具核梭杆菌、变异链球菌、中间普氏菌等细菌的增殖，达到有效抗菌；且对DPSC的细胞毒性小，具有良好的生物相容性。
多种研究报道了抗感染纳米纤维在口腔感染中的潜在应用。尽管缺乏基于临床研究的文献报道，但基于当前的研究，可以认为纳米纤维是REP的一个潜在选择，其能够有效控制感染且减小对干细胞的细胞毒性，同时可作为组织再生的支架，但要想实际应用于临床，还需进一步的深入研究与探索。
5.总结与展望
在REP中，感染控制对REP的成功至关重要，其对REP预后的影响主要可归因为两大点，一是根管内细菌残留，二是药物的细胞毒性，两者均会影响干细胞活性和生长因子的释放，从而干扰组织再生和牙根继续发育。随着新型根管冲洗剂、冲洗技术和新型抗菌药物支架的研发，能够较好地解决以上问题。虽然目前对REP中抗菌纳米纤维的研究尚处于起步阶段，未大量开展体内研究和临床研究，基于其在体外研究中表现出来的有效抗菌作用和优良的生物相容性，笔者认为其可能是REP中一种有前景的感染控制支架，能够进一步改善REP的预后。
