槟榔提取物抑制人类口腔粘膜角朊细胞生长的实验研究
摘要 目的:建立人类口腔粘膜上皮角朊细胞体外原代培养方法;探讨口腔粘膜下纤维性变（OSF）患者上皮厚度改变的机理。方法:先对人类口腔粘膜上皮角朊细胞（KC）进行分离、培养和鉴定，然后用四唑盐（MTT）比色试验检测OSF患者和正常人口腔粘膜上皮KC增殖状况，并且观察槟榔提取物（ANE）对KC增殖的影响。结果:体外培养的KC呈多边形，胞浆内有丰富的张力细丝，表面有大量微绒毛，角蛋白抗体免疫组化染色呈阳性。且体外培养的OSF患者KC与正常对照组KC增殖无明显差异，ANE以浓度-效应依赖关系抑制KC增殖。结论:用dispase消化培养法可成功地培养出纯净的KC； ANE对口腔粘膜KC有细胞毒作用。
关键词 角朊细胞 槟榔提取物 口腔粘膜下纤维性变 细胞增殖口腔粘膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的炎性疾病。其主要病理特征是粘膜下固有层胶原的异常堆积，造成患者对辛辣刺激性食物有烧灼性疼痛和渐进性的张口困难等症状［1］。OSF患者往往伴有口腔粘膜上皮异常改变，多数表现为上皮萎缩，少数表现为上皮增生［2］。世界卫生组织将OSF列入癌前状态，Paymaster统计约有1／3此类病变会转变为口腔鳞状上皮癌。大量研究结果表明咀嚼槟榔习惯与OSF的发生密切相关［3］。为了探讨OSF病变组织上皮厚度变化是否与口腔粘膜上皮角朊细胞（keratinocyte，KC）本身的增殖状况以及与槟榔刺激物对KC增殖的影响有关，本研究采用四唑盐比色法(MTT法)测试体外培养的KC增殖水平，比较OSF患者角朊细胞(OSF-KC)与正常对照组角朊细胞(NM-KC)体外增殖水平，并观察槟榔提取物（areca nut extract， ANE）对KC增殖的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基（Gibco），小牛血清（杭州四季青生物制品厂），分散酶dispaseⅡ（Gibco），胰蛋白酶（Sigma），兔抗人角蛋白多克隆抗体（Zymed），鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体（Zymed），MTT溶液（5mg／ml，Sigma），96孔培养板（Nunclon公司），Ele312酶标仪(美国）。
1.2 方法
1.2.1 ANE的制备 参考Van Wyk等［4］的方法制备。将市售槟榔碾成粉，称取50 g槟榔粉溶于200 ml三蒸水中，振动混匀1 h,于4℃放置24 h,过滤。滤液冷冻干燥，60℃烤干，再将槟榔提取物干粉称重，溶于三蒸水中，配制成25 mg/ml的贮存液，使用前用DMEM稀释成所需浓度。
1.2.2 KC的培养与鉴定 所有口腔粘膜标本均取自1997年7月到1998年4月在湖南医科大学附属第二医院就诊者。选择经临床及病理检查确诊为OSF患者病变部位的口腔粘膜作为实验组,同时从无烟酒、槟榔及辣椒嗜好，年龄与实验组匹配的自愿者取正常粘膜作对照组。新鲜粘膜用含抗菌素的PBS充分洗3次，浸泡入2.4 U／ml dispase Ⅱ溶液中，37℃消化2 h后分开表层上皮和上皮下组织，上皮片再用0.25％胰蛋白酶消化吹打使KC分离形成单个细胞悬液，用含10％小牛血清的DMEM终止消化，离心，将细胞团置于培养基中，吹打均匀，用台盼蓝染色进行活细胞计数，以 2×105／ml的密度接种培养。采用透射电镜、扫描电镜观察细胞超微结构以及用ABC法对培养细胞进行角蛋白免疫组化染色的方法对培养KC进行鉴定。
1.2.3 KC细胞增殖状况的检测 采用MTT法检测KC细胞增殖状况。将KC以2×105/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μl。培养6 d后，换用含不同浓度ANE的条件培养基，ANE的最终浓度为0.5、50、100、150 μg/ml。培养48 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加人150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min,使结晶物充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪中测定各孔OD值，记录结果。
1.2.4 统计学方法 所有实验数据均输入计算机,应用SPSS软件进行数据分析。OD值采用±s表示。均数比较采用方差分析，OD值与ANE浓度的关系采用回归分析,检验水准α＝0.05。