Smad4基因在人牙乳头细胞内的表达及其意义的探讨
摘 要：目的：观察转化生长因子-β超家族特异的细胞内信号转导基因Smad4在人牙乳头细胞内的表达，及其在转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形成蛋白-2(BMP-2)作用下的变化,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代培养人牙乳头细胞，用TGF-β1和BMP-2刺激培养的细胞，分别从刺激前后的细胞中提取总RNA和总蛋白,采用Northern和Western印迹杂交方法，从mRNA和蛋白水平观察Smad4基因的表达及变化。结果：从mRNA和蛋白水平观察到Smad4基因在人牙乳头细胞内的表达。但在TGF-β1和BMP-2作用下表达无变化。结论：研究证实Smad4基因在人牙乳头细胞内的表达，Smad4基因在信号转导过程中无量的变化，其活化可能是通过蛋白磷酸化途径实现的。
关键词：人牙乳头细胞，Smad4，转化生长因子-β1，骨形成蛋白-2
转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形成蛋白-2(BMP-2)作为转化生长因子-β超家族的成员，在牙齿发育,特别是成牙本质细胞终末分化中发挥重要的，甚至是关键的调控作用［1～4］。目前国内外研究认为，牙齿发育过程中成牙本质细胞终末分化，是由许多生长因子组成的分子网络共同调控发生的，其中TGF-β1和 BMP-2起关键的调控作用［2～5］。但TGF-β1和 BMP-2在成牙本质细胞和牙乳头细胞内的信号转导途径及其调控基因表达方式仍然未能阐明。1996年以后，Smads基因家族的发现，是TGF-β1和 BMP-2信号转导研究的一个突破性的进展。
目前，有关TGF-βs和 BMPs人牙乳头间充质细胞内信号转导途径研究，TGF-βs和BMPs在人牙乳头间充质细胞内信号转导是否通过Smad4信号转导途径转导至核内，报道较少。本文目的是观察培养的人牙乳头间充质细胞是否存在Smad4的表达，及在TGF-β1和BMP-2不同时间的刺激条件下其mRNA和蛋白的表达变化，阐明TGF-βs和BMPs在人牙乳头间充质细胞内的信号转导途径。1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月胎儿，取其牙乳头，组织块法［1］原代培养人牙乳头细胞。培养液为含150ml/L胎牛血清（fetal calf serum,FCS）的DMEM培养液（Gibco,USA）。取生长良好的第5代牙乳头细胞，以浓度3×105/L接种于新的75ml培养瓶,每瓶1ml,加4ml含100ml/L FCS的DMEM的培养液，3d后用含2ml/L FCS的DMEM培养液清洗并培养3h。用含100pmol/L TGF-β1（Promega）和10nmol/L BMP-2(Promega)的2ml/L FCS的DMEM培养液分别刺激并培养6、12、24和48h。对照组继续用含2ml/L FCS的DMEM的培养液培养，不加任何刺激。弃去培养液，用冰冷的1mol/L PBS终止并清洗细胞后，用于以下实验。
1.2 Smad4 mRNA表达
1.2.1 总RNA的提取
刺激组和对照组细胞用TRIZOL试剂盒提取（LIFE TECHOLOG?ES）总RNA，溶于40μl的1g/L焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水中。取5μl电泳鉴定提取总RNA有无明显的降解。取3μl RNA，用1g/L DEPC水稀释到600μl，分光光度计测定其A260和A280，以确定RNA的纯度和含量。用1g/L DEPC水稀释每组RNA样品至相同的浓度，保证上样量一致。
1.2.2 探针的制备
PDH105/Smad4重组质粒(Dr. Malcolm Whitman, Department of Cell Biology, Harvard Medical School,惠赠)转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆，大量培养，用质粒提取试剂盒（上海华舜公司）提取质粒，BamHI酶切消化，10g/L低熔点胶琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒（上海华舜公司）回收目的片段。用缺口平移试剂盒（华美公司）同位素(α-32P)dATP（11.1×109Bq/mol,购自北京亚辉公司）标记Smad4 cDNA探针。
1.2.3 Northern 印迹杂交
从人牙乳头细胞提取的RNA经甲醛变性后，10g/L琼脂糖变性胶电泳，每孔30μg，以毛细管转移方法将RNA转至硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜置入聚乙烯杂交袋中，加入预杂交液：500ml/L去离子甲酰胺，5mol/L SSPE(含氯化钠、磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸钠二钠盐)，2mol/L Denhart试剂（含多聚蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白第五组份），10g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，鲑鱼精DNA，弃去气泡，封住袋口，置42℃水浴4h，在预杂交液中加入以煮沸变性的α-32P标记的Smad4探针。42℃水浴杂交24h。洗膜：倾出杂交液，2mol/L SSC(含氯化钠，枸橼酸钠)，1g/L SDS, 室温洗膜20min；1mol/L SSC, 5g/L SDS, 42℃洗膜30min；100mmol/L SSC, 5g/L SDS,56℃洗膜30min。X线片-70℃放射自显影7～10d，暗室显影5min,定影7min，观察结果。