α-SMA在金地鼠颊囊癌变过程中的动态观察

　　提　要　目的　动态观察金地鼠颊癌变过程中α-SMA表达规律，并分析其表达和癌变间的相关性。方法　采用免疫组化技术检测金地鼠颊囊白斑癌变模型标本的α-SMA表达情况。结果　在轻、中、重度异常增生及癌各组间，α-SMA 表达减少有显著差异。随病变恶性程度增加，α-SMA的表达量减少。结论　α-SMA是一种良好的癌前病变辅助诊断指标。

　　关键词　金地鼠颊囊　　α-SMA　　癌前病变

材料和方法

　　材料

　　1. 实验动物：叙利亚品系金地鼠48只，由上海西普尔-BK公司提供。

　　2. 缓冲液配置（TRIS—HCL液，0.5M，pH7.6）：TRIS 61g,加入340ml Hcl,用800ml蒸馏水充分混匀后，再以蒸馏水定容至1000ml。

　　3. 免疫组化试剂：ABC试剂盒由DAKO公司提供。

　　方法

　　1. 实验动物分组

　　空白对照组：6只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.9％NaCl液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共6例。

　　模型组：42只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.5％DMBA丙酮液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共42例。

　　2. α-SMA检测

　　取下的组织块常规石蜡包埋，连续切片2份各约5μm厚，一份HE染色光镜下病理分级;一份60℃烘箱内放置40分钟后，恒温箱中保持24～48小时，准备作α-SMA免疫组化染色。

　　免疫组化染色步骤如下

　　2.1 脱蜡水化：恒温箱中取出切片，二甲苯中15分钟×3次→100％、95％、90％、80％、70％梯度乙醇液中，每次均为5分钟→蒸馏水冲洗干净。

　　2.2 微波处理修理丢失的抗原决定簇：脱蜡水化后切片置缓冲液洗5min×3次，再置0.1M柠檬酸缓冲液中微波处理10min。

　　2.3 α-SMA染色前处理：缓冲液洗涤5min×3次→0.2％ Triton-X 100中10min→清水冲洗5min×3次→0.3％H2O2中浸泡5min→5％牛奶中孵育30min。

　　2.4 α-SMA染色：常规ABC法。

　　3. 光镜下病理分级：标准参照1978年WHO口腔癌前病变协作中心诊断标准。

　　观察与计数

　　每侧高倍镜下计算相邻3个视野内α-SMA连续性染色血管密度值（连续性染色血管数／视野内血管总数×100％），取平均值。

　　统计学处理

　　采用单因素方差分析，Duncan法组间两两比较和相关分析。

结　果

　　1. 光镜下病理分级结果

　　正常粘膜6例，炎症7例，轻、中和重度异常增生分别为12例、11例和9例，癌3例。

　　2. 免疫组化检测结果

　　涂DMBA不同周数组间α-SMA检测结果（表1）。

表1　涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度（％）

  涂DMBA周数例数第4周754.02±30.61第5周736.79±24.26第6周735.95±22.89第7周727.52±18.32第8周719.28±17.50第9周715.33±14.58

图1示：随涂DMBA周数的增加，α-SMA表达量呈渐进性下降。

图1　涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度（％）

　　从表2可见，正常颊囊粘膜与炎症组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度无显著性差别（P＞0.05）；鳞癌组较重度异常增生组粘膜下α-SMA连续性染色血管密度下降有显著性差别（P＜0.05）；其余各组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度有高度显著性差别（P＞0.01）。

表2　不同病理变化组间颊囊粘膜下α-SMA连续性染色血管密度（％）

病理分级例数x±sα=0.05α=0.01正常粘膜6100.00±0.00AA炎　　症7100.00±0.00AA轻度异常增生1256.35±8.45BB中度异常增生1120.86±5.50CC重度异常增生99.22±2.02DD癌32.64±0.35ED

变量转换后，采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同为无显著差别。

图2　正常粘膜血管α-SMA染色（140倍）

图3　异常增生粘膜血管α-SMA染色（140倍）

　　3. 相关分析结果

　　α-SMA连续性染色血管密度与病理分级呈高度负相关，即随病变恶性程度增高，α-SMA表达量下降（P＜0.01）。