人牙周膜成纤维细胞分离、纯化培养及生物学特性观察

　　提　要　采用胶原酶及胰蛋白酶联合消化法，简便、快速地获得大量成活率高的人牙周膜细胞。在DMEM培养基中进行了原代及传代培养，对其中的成纤维细胞进行分离纯化。相差显微镜下，牙周膜成纤维细胞呈星形或长梭形，免疫组化波丝蛋白阳性，角蛋白阴性，证实该细胞来源可靠。酶消化法不失为一种简便、快速、可靠的细胞原代分离培养方法。

　　关键词　牙周膜　　牙周膜成纤维细胞　细胞培养

　　细胞培养是现代医学及生物学常用的一种重要研究方法。自七十年代以来，国外学者对牙周膜细胞（Periodontal Ligament Cells PDLC)分离纯化进行了大量的探索和研究，并成功地从猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞〔1，2〕。牙周膜细胞培养主要有两种方法，即酶消化法和组织贴块法。国内九十年代报道了用组织贴块法培养人牙周膜成纤维细胞（Periodontal Ligament Fibroblasts, PDLF)，该法获取细胞种类单一，培养时间较长〔3〕。本研究采用胰蛋白酶一胶原酶联合消化法，在短时间内简便、快速地获取大量人牙周膜成纤维细胞，并进行了免疫组织化学鉴定、原代及传代培养，对其基本生物学特性进行了初步观察。

材料与方法

　　1. 实验材料及主要仪器设备

　　DMEM培养基（Gibco, USA), 胶原酶（Type I, Sigma, USA),胰蛋白酶（Gibco, USA), 小牛血清（华西医科大学分子生物学实验室产品），ABC免疫组化试剂盒（Vector, USA),二氧化碳恒温培养箱（Heraeus, Germany), YJ_2450医用净化工作台，（苏州净化设备厂），倒置相差显微镜（Olympus, Japan), 其它为国产分析纯。

　　2. 人PDLC的原代培养

　　人牙周膜取自华西医科大学口腔医院口腔外科门诊因正畸或阻生拔牙的患者，患者年龄在12～29岁的范围，平均年龄16.6岁。所选牙齿均无龋坏、尖周炎及牙周炎。拔牙后立即在无菌条件下，用加入抗生素的生理盐水反复冲洗牙根部，用手术刀刮取牙根中2/3牙周膜，移入离心管内。PBS冲洗2次后，加入0.125％ 胰蛋白酶及0.1％胶原酶5ml,37℃振荡下消化30～60min。镜下观察，组织松散、大部分细胞游离时，用吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经190目筛过滤，收集并离心（1000 r/min, 10 min）， 弃去上清液。加入含10％小牛血清的DMEM培养基，充分吹打细胞悬液，血细胞计数板计数，台盼蓝拒染检测分离的人牙周膜细胞活性。

　　将细胞按4×105／瓶 接种于25cm2培养瓶，加入4 ml DMEM培养基，内含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml，于二氧化碳孵箱内培养。培养条件为5％CO2、95％空气、37℃、饱和湿度。待细胞贴壁后，隔日换液。

　　3. PDLC传代培养

　　细胞长满单层后，即可进行传代。利用不同细胞对胰蛋白酶敏感性不一致,来分离人牙周膜成纤维细胞和上皮细胞。胰蛋白酶消化成纤维细胞比上皮细胞速度快，时间短。首先弃去原培养基，用PBS洗涤一次，加入0.125％胰蛋白酶2ml，相差显微镜下观察，几分钟后可见大多数牙周膜成纤维细胞已收缩变圆，与瓶壁分离，余下的细胞继续消化十几分钟，将早期和晚期消化下来的细胞分别收集并接种到新的培养瓶，加入培养液继续培养。

　　4. PDLF的形态学观察

　　体外培养细胞的倒置相差显微镜观察。

　　5. 免疫组化鉴定

　　将培养的第三代人牙周膜成纤维细胞接种于置有盖玻片的培养皿中，待细胞长至半满时取出玻片。经丙酮固定，吹干，按常规ABC法操作，进行波丝蛋白、角蛋白染色，光镜下观察胞质染色情况。

结　　果

　　1. 一般生长情况

　　最初接种的细胞为圆形，呈悬浮状态。接种24小时后细胞开始贴壁，48小时后几乎全部贴壁。贴壁后的细胞开始伸展变形，多数细胞形态呈长梭形或星形（图1），也有少数呈扁平多角形，似上皮样细胞。从第三天起，细胞生长加速，长梭形及星形细胞增殖活跃，多角形细胞生长相对较缓慢，细胞大约经历一周后开始形成单层，长梭形细胞占绝对优势。