体外培养的人牙乳头间充质细胞的矿化特征
摘 要：目的：观察体外培养的人牙乳头间充质细胞矿化特征，深入研究成牙本质细胞的分化和牙本质形成。方法：第4代人牙乳头间充质细胞连续培养35d后，进行组织学染色，透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察。结果：人牙乳头间充质细胞可出现复层生长和形成矿化结节；von Kossa染色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积；细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出现典型的矿化影像。结论：体外培养的人牙乳头间充质细胞的矿化过程可能与基质小泡有关。
牙乳头间充质细胞(dental papilla mesenchymal cells, DPMC)作为牙胚发育过程中唯一具有分化为成牙本质细胞能力的间充质细胞群，是研究牙齿发育特别是牙本质形成的重要模型。本实验观察体外培养的人DPMC矿化特征，为研究人DPMC的分化和矿化及其影响因素探讨新的方法。
1 材料和方法
1.1 材料
DMEM培养基(Gibco，USA)；胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)；β-磷酸甘油(Sigma，USA)；L-抗坏血酸(Sigma，USA)；胰蛋白酶(Gibco；USA)；24孔细胞培养板(Gibco，USA)；YMT-Z型倒置显微镜(Olympus；Janpan)；CO2孵箱( Forma Scientific，USA)；YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
牙乳头组织取自合法水囊引产的7月龄男胎，用组织块法进行原代细胞培养,取生长良好的第4代人DPMC，用2.5g/L胰酶消化后，以2×103/L细胞浓度接种于铺有无菌盖玻片(6mm×6mm)的24孔板中，在含150ml/L FCS、10mmol/L β-磷酸甘油和50mg/L抗坏血酸的DMEM培养液中连续培养35d，每组4孔。倒置显微镜观察细胞生长情况，3～4d换液1次。标准环境下培养。
1.2.2 组织学染色
用常规von Kossa染色法对培养细胞进行染色。将载有细胞的盖玻片自24孔培养板中取出，PBS洗3遍，丙酮固定，含50g/L AgNO3的福尔马林液还原2min，蒸馏水清洗，快红复染胞核。为排除von Kossa染色的假阳性，用20g/L茜素红S（pH4.2，5min）抽查von Kossa染色阳性实验组的标本。
1.2.3 透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察
35d后，用0.01mol/L(pH7.2)PBS稍浸洗，30ml/L戊二醛液4℃下固定1h，10g/L四氧化锇液后固定1h，0.1mol/L PBS清洗3次,每次5min,300～1000g/L梯度丙酮脱水,环氧树脂Epon812包埋液浸20min,显微镜下选取结节原位包埋［1］,常规制作超薄切片,经醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色后,透射电镜观察。或用30ml/L戊二醛固定后，乙晴梯度脱水，临界点干燥，扫描电镜观察。2 结果
2.1 细胞生长情况
人DPMC在连续培养中仍保持成纤维细胞样形态，圆型或椭圆形细胞核位于细胞中央，核仁清楚。在培养的第9天后，细胞接触融合，呈旋涡状生长和复层生长；融合后5～7d，倒置显微镜下可见团状区域扩大，密度增高，边界不清，形态各异；随着培养时间延长，细胞继续分裂增殖，结节逐渐增大并互相融合，肉眼呈白色点状，倒置显微镜下呈白色团状(图1)。
图1 培养35d 人牙乳头间充质细胞结节 (倒置显微镜，10×)
2.2 钙盐染色
将连续培养35d的两组细胞进行von Kossa染色。阳性区与肉眼观察的白色点状物和镜下见的白色团块相吻合。阳性中央区为深褐色，周围逐渐变浅。各组细胞结节的von Kossa染色结果与茜素红S染色一致。提示细胞结节中有明显的钙盐沉积(图2)。
图2 培养35d 人牙乳头间充质细胞结节 (钙盐染色，10×)
2.3 TEM观察结果
连续培养的人DPMC的超微结构基本相似，但结节区细胞与正常人DPMC相比，存在一些特殊的形态结构。细胞的胞浆内可见大量高尔基氏器位于中央区，其成熟面有密度不等的泡状结构；有时可见细胞呈长柱状，有大量的粗面内质网和线粒体沿细胞长轴分布；还可见极化的细胞核；胞间基质中可见胶原纤维呈束状排列，并有致密小体的泡状结构，类似于基质小泡(图3)。 部分基质小泡开始有钙盐沉积。