体外连续培养人口腔粘膜角化细胞

关键词：细胞培养；口腔粘膜；角蛋白

　　【摘要】　目的　建立一个稳定的人正常口腔粘膜角化细胞体外培养体系。方法　取正常口腔粘膜,经Dispase及胰蛋白酶消化获取细胞，采用无血清培养液进行原代及传代培养，并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等一系列细胞定性研究。结果　获取的细胞为单一上皮细胞；细胞可连续传4～5代，成活30～50　d；细胞呈铺路石状，为上皮细胞的典型形态；电镜下见细胞具有丰富的张力丝和桥粒等特征性超微结构；角蛋白免疫组化染色阳性。结论　应用Dispase酶及无血清培养液，在无3T3细胞的条件下可成功进行人正常口腔粘膜角化细胞连续传代培养。

　　多年来，我们依托金黄地鼠为动物模型对口腔粘膜癌前病变的发生、发展及阻断进行了大量的研究，取得了一定的成果。但以动物模型作为研究手段尚存在一定缺陷，如实验周期长、 费用高、 无法排除人与动物之间的种属差异等，影响研究成果向人体的临床转化。与动物模型相比，细胞培养体系易于控制周围的环境条件，避免了整体实验中神经体液的综合调控因素及多种细胞之间的相互作用，研究样本可达到相对均一性，实验周期短、重复性好，便于用现代化手段进行分析，无需使用大量的活体动物，研究经费相对经济［1,2］。因此，我们设想建立一个稳定的人类正常口腔粘膜角化细胞体外培养体系，以期为研究粘膜上皮癌变过程及阻断和治疗提供实验性的新手段。

　　材料与方法

　　一、 原代及传代培养

　　无菌条件下取健康人拔智齿时切除的龈粘膜或口腔整复术中切除的口腔粘膜（年龄＜50岁）。PBS冲洗，除去粘膜下组织，剪成约5 mm×5 mm的小块，加入0.25% Dispase(美国GIBCO),4 ℃消化16～18 h，将表层上皮及上皮下层分开。上皮层加入混合消化液中(0.25%胰蛋白酶∶0.02% EDTA=1∶1)，37 ℃振荡消化5～10 min，加小牛血清终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。洗涤，弃上清，加入角化细胞培养液(美国GIBCO)，红细胞计数板计数。以0.25×104个细胞/cm2的密度接种于35 mm直径的塑料培养皿中(丹麦NUNC)，置37℃ 5%CO2饱和湿度细胞培养箱(美国NAPCO)中培养。第3天首次换液，以后每2 d换液1次。 细胞长至培养皿的80%时传代。用混合消化液，37 ℃消化3～5 min，镜下见胞质回缩即终止消化。以1∶2或1∶3接种入新培养皿。

　　二、 形态学观察

　　用相差显微镜每日动态观察细胞形态变化及生长增殖情况；用光学显微镜观察长有细胞的玻片，HE染色。