促牙本质再矿化树脂粘接材料提高牙本质粘接耐久性的研究进展
随着人们对舒适、微创和美观的不断追求，目前牙体缺损修复已广泛使用树脂粘接技术，同时树脂粘接的成功率与长期效果也引起了人们的注意。“牙本质湿粘接”方法是指酸蚀牙本质中的羟基磷灰石，暴露出多孔网状形态的胶原纤维，树脂粘接剂中的单体渗入蓬松的多孔网络中形成混合层和树脂突。
牙本质湿粘接中胶原纤维蓬松状态是形成高质量混合层的前提，然而临床操作中表面水分的多少很难控制。若粘接面水分不足会使胶原纤维塌陷，水分过多使粘接剂渗入困难导致牙本质封闭不佳。此外，存在于牙本质中的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）会破坏裸露的胶原纤维引起胶原纤维老化，导致粘接界面不稳定，从而影响牙本质粘接的远期效果，导致术后敏感，边缘微渗漏，继发龋，充填体脱落等问题。
因此，为保护牙本质中胶原纤维状态的稳定，国内外研究均提出用诱导混合层裸露胶原再矿化的策略，来提高树脂-牙本质粘接耐久性。本文从以下三方面进行阐述：生物活性无机微填料策略；仿生再矿化策略以及其他促牙本质再矿化的策略。
1. 生物活性无机微填料策略
用于树脂粘接剂改性的无机微填料包括硅酸盐、磷酸钙盐、生物活性玻璃等，这些无机微填料在粘接面提供外源性无机矿化离子来源，在混合层微环境中形成沉积物置换水分，稳定胶原纤维状态，从而提高树脂-牙本质粘接耐久性。
1.1硅酸盐
应用于牙本质再矿化的硅酸盐材料主要指硅酸二钙、硅酸三钙的水合产物，例如三氧化矿物聚合物（mineral trioxide aggregate,MTA）。硅酸盐材料溶解于液体中发生水合反应可生成水化硅酸钙和结晶性氢氧化钙，后者释放Ca2+和OH-。Ca2+为再矿化提供丰富的钙离子来源；OH-使局部pH升高形成碱性环境，这有利于矿物沉积，同时抑制MMPs活性保护I型胶原纤维不水解，此外还具有一定抗菌性。
2013年有学者对硅酸盐材料能否促进牙本质再矿化进行探索研究。该研究将硅酸钙为主要成分的波特兰水泥作为微填料加入树脂粘接剂中。实验对37%磷酸酸蚀的无龋离体牙牙本质样品进行粘接处理，结果显示该材料能够有效提高树脂-牙本质粘接界面微拉伸结合强度(microtensile bond strength,μTBS)，并能实现6个月的μTBS稳定。扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM)检测样品脱粘面的表面形貌，观察到丰富的矿物质沉积，这些矿物质嵌入了保存完好的胶原纤维网络中。激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）检测结果显示实验材料可以在脱矿牙本质中扩散，形成8-14μm混合层，大量树脂突穿透牙本质小管并在6个月后保持稳定。
Bendary等2022年的研究中，应用自然界中存在的硅灰石作为无机填料进行树脂粘接剂改性实验。表征结果显示该材料微观结构呈针状，平均直径为（70±30）μm，为纯结晶β-CaSiO3相。显微拉曼光谱获得的图像表明，含硅灰石的粘接剂在模拟体液中浸泡后，矿物沉积量增加。这是由于CaSiO3中的Ca2+释放到模拟体液中，Ca2+与羟基交换，在聚合物表面形成带负电荷的硅醇基，从而吸引更多Ca2+，形成矿物沉积。此外，实验组的树脂-牙本质粘接强度虽然在24 hμTBS低于对照组，但在老化1年后与对照组μTBS无明显差异，提示硅灰石有助于保持粘接稳定性。
硅酸盐类微填料能够使粘接混合层中形成矿物沉积，这些沉积物嵌入胶原纤维网络，保持树脂突和牙本质胶原的嵌合状态，从而使粘接强度保持稳定，在提高牙本质粘接耐久性方面有一定潜能。但目前的研究中，不同硅酸盐填料的最佳含量并未统一，且再矿化的形貌检测仅在微米级别，是否实现了牙本质纤维内矿物质晶体的有序沉积尚不能明确判断。
1.2磷酸钙盐
磷酸钙盐材料含有的钙、磷是牙本质矿物相羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）的主要元素，国内外多项研究很早将其应用在牙本质再矿化实验中。不同钙/磷摩尔比的磷酸钙盐有不同的溶解度，一般来说，较低的钙/磷比对应于酸性和相对水溶性更好的磷酸钙相。
牙本质树脂粘接方面最广泛应用的是无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate,ACP）。ACP是Ca2+与PO43-形成的无定形相前驱体，尺寸小，内部含有高达10%～20%的水，具有“流动性”。应用溶液沉淀法可以制备ACP，但其性能极其不稳定，容易相变成HA，必须加入无机物或大分子聚合物阻止其迅速相变。
2020年Krithi等的研究中应用酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide,CPP)-ACP对脱矿牙本质进行90 d再矿化处理。SEM结果显示CPP-ACP组的牙本质表面可见沉积物，但微剪切结合强度测试结果显示CPP-ACP并未明显提高牙本质-树脂粘接界面的粘接强度。这表明CPP-ACP能够在粘接混合层形成沉积物，但不能有效提高粘接性能，可能与CPP-ACP过早地沉积在混合层表面有关。
Zhou等的研究进一步明确了CPP-ACP的矿化潜能，将三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate,TPP）联合CPP-ACP处理脱矿牙本质，其再矿化效果确切。脱矿牙本质经过21 d再矿化处理，SEM结果显示牙本质小管被沉积物完全封闭，TEM结果显示出现周期性横纹结构，代表实现了纤维内再矿化，XRD结果显示样品的晶体结构与健康牙本质非常接近。在这项研究中，牙本质胶原纤维首先被TPP磷酸化，为钙磷离子进入胶原纤维提供成核位点，CPP稳定的ACP穿透胶原纤维完成再矿化过程。与单独使用CPP-ACP相比，TPP与CPP-ACP联合能使再矿化发生在牙本质胶原纤维内部。不过该研究并未涉及CPP-ACP应用于牙本质树脂粘接方面的实验。
2021年Moreira等对体外人工龋脱矿牙本质进行1 min CPP-ACP再矿化预处理和树脂粘接处理，结果显示，CPP-ACP实验组样品μTBS值明显高于对照组样品，并在18个月后仍保持明显优势，断裂模式以混合断裂为主。微计算机断层扫描（micro-computed tomography,m-CT）结果显示实验组粘接界面的矿物质密度明显高于对照组。粘接界面的纳米渗透结果显示实验组18个月后的封闭性优于对照组，孔隙率低。该研究证实应用CPP-ACP处理受龋齿影响的牙本质能够有效提高粘接混合层的矿物含量，改善其封闭性和粘接性能。
CPP稳定的ACP能够在牙本质胶原中形成沉积物，并且在TPP的联合作用下，CPP-ACP能够实现可靠的牙本质纤维内再矿化。此外，CPP-ACP在提高患龋牙本质的树脂粘接耐久性方面有积极作用。
1.3生物活性玻璃
生物活性玻璃（bioactiveglass,BAG）是一种高生物相容性的钙/磷酸钠硅酸盐，最初作为一种骨修复材料得到广泛应用，其化学成分与天然牙齿的矿物成分相似，可释放矿化相关离子如Ca2+,OH-,PO43-，具有一定的牙本质再矿化潜能。
Tauböck等2014年将纳米尺寸的BAG颗粒添加在树脂粘接剂中，结果显示含20 wt%BAG的实验组样品在模拟体液中浸泡21 d后形成磷酸钙晶体，但10 wt%与20 wt%两组样品的努氏硬度均低于对照组。2017年Fernando等在系统性回顾研究中提出BAG能够有效地刺激脱矿牙本质表面形成磷灰石，但无足够证据表明BAG可提高脱矿牙本质的机械性能。
2018年Jang等提出添加有BAG的改性树脂粘接材料提高了邻近区域脱矿牙本质的显微硬度，在使用了BAG改性树脂粘接材料的牙本质表面，傅里叶变换衰减全反射红外光谱法检测显示具有磷酸钙特征峰，场发射扫描电镜（field emission scanning electron microscope,FE-SEM）检测牙本质表面有沉积物，其机理主要归因于BAG释放出离子形成微晶状沉淀物。
2021年Oltramare等应用BAG改性树脂粘接材料处理牙本质样品，并在24 h和6个月后检测树脂-牙本质粘接强度，μTBS结果显示含5 wt%BAG的树脂粘接剂不会影响短期和长期的粘接性能，高于5 wt%则有可能降低μTBS值。分析原因可能为BAG与树脂粘接剂的酸性组分发生了酸碱反应。高含量的BAG与树脂酸性组分反应，影响了树脂的渗透能力和填料的生物活性。2021年有研究同样证实含3 wt%BAG的树脂粘接剂能有效降低牙本质的渗透率而不影响μTBS值。
BAG能释放矿化离子促进矿物质沉积并结晶,降低牙本质渗透率，但缺点是高浓度的BAG填料会影响粘接机械强度。
2. 仿生再矿化策略
近年来，以非经典结晶理论为基础的仿生再矿化策略被广泛认可。
牙本质生物矿化中，NCPs起诱导和调节矿化的作用，使HA在牙本质I型胶原纤维支架中有序沉积。仿生再矿化策略的目标是模拟NCPs，实现与生物矿化接近的纤维内再矿化、纤维间再矿化和纤维外再矿化。仿生类似物需要具备NCPs的双重功能，包括稳定矿物前驱体ACP的功能和引导特定位点再矿化的功能。
2.1多聚阴离子
非经典的结晶理论认为，聚阴离子电解质将Ca2+与PO43-组装成ACP可以实现纳米材料的自组装过程，形成具有接近自然矿化组织形态、尺寸及分级结构的矿化胶原组织。He等2019的研究提出大分子量的聚电解质比小分子量的聚电解质更能将ACP稳定在无定形状态，这些纳米级别的小尺寸ACP可以更好地深入胶原纤维内部，具有更高的再矿化效率。目前已有多种聚阴离子如聚天冬氨酸（polyaspartic acid,PAsp），聚丙烯酸（polyacrylic acid,PAA)和聚谷氨酸等被用来稳定磷酸钙溶液，有证据表明无定形矿化前体在胶原内部而不是胶原表面形成晶体。
吴志芳以自酸蚀粘接剂作为ACP纳米前驱体的载体对牙本质仿生再矿化进行探索，透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）观察实验中研制合成的PAsp-Si-ACP和PAspACP圆球形纳米颗粒直径为20-80 nm，以20 nm居多，该尺寸的纳米颗粒能够进入胶原纤维间，PAsp-Si-ACP与PAsp-ACP均可实现I型胶原的纤维内再矿化，并且PAsp-Si-ACP比PAspACP对I型胶原的矿化速度更快，提示Si具有促矿化作用，然而其机理并不明确。细胞毒性实验结果显示PAsp-Si-ACP有良好的生物相容性。自酸蚀粘接剂中加入25 wt%PAsp-Si-ACP填料对脱矿牙本质的再矿化效果确切，3个月后样品出现2µm厚的再矿化层，但再矿化效率有待提高。
2.2壳聚糖的衍生物
壳聚糖由甲壳素脱乙酰化生成，来源丰富，且具有良好的生物相容性，壳聚糖的衍生物羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan,CMC）具有丰富的羧基官能团，是一种NCPs类似物，能够稳定ACP。Chen等制备了CMC/ACP支架材料，以完全脱矿牙本质为实验对象设置体外深龋模型，进行牙本质再矿化研究，TEM观察CMC/ACP颗粒直径小于50 nm，完全脱矿的牙本质经过CMC/ACP处理出现周期性横纹结构，提示实现牙本质胶原纤维内再矿化。
2017年国内的一项研究利用磷酸化壳聚糖(phosphorylated chitosan,Pchi)有效促进了I型胶原的再矿化，加快了PAA稳定的ACP的相变。一项关于壳聚糖再矿化作用的系统回顾性研究对2010年至2015年间Pubmed和Medline数据库进行分析，提示壳聚糖被用于牙本质再矿化的剂型有多种，包括溶液、微球、水凝胶、牙膏等，在预防牙科中有重要作用。
2022年的一项研究中，学者将脱矿牙本质浸泡于含复合硅酸盐树脂与CMC的PBS缓冲溶液中，结果显示CMC能够提高粘接剂的强度和耐久性，其机理为胶原纤维间隙被矿物质填充，并且CMC能诱导牙本质纤维内矿化从而使粘接界面具有更高的耐热应变聚集，在经过热循环后形成的裂纹更少。
2.3聚酰胺-胺树枝状聚合物（poly amido-amine,PAMAM)
PAMAM由于具有其树枝状结构特点与富含官能团的优点，能够稳定ACP。有研究提出即使在没有初始钙和磷酸盐离子的酸性溶液中PAMAM也能诱导牙本质再矿化，有效提高脱矿牙本质的显微硬度。PAMAM-peptide@galardin在研究中被用于保护牙本质胶原纤维，稳定和促进仿生再矿化，该研究进行了动物实验以评价材料的抗龋性能，实验组大鼠的牙本质龋损范围较对照组小，且磨牙牙本质区域矿物密度更高，提示其具有一定的牙本质修复的潜力。
PAMAM与洗必泰联合能够更好地实现脱矿牙本质再矿化，提高树脂-牙本质的粘接强度。2022年的一项研究制备了载有洗必泰的PAMAM，讨论使用该材料与含ACP的树脂粘接剂结合能否提高粘接耐久性。酶活性检测与细胞毒性检测结果提示PAMAM保留了洗必泰抑制MMPs活性的作用，降低了洗必泰的细胞毒性，且牙本质树脂粘接μTBS明显高于对照组，有效提高了粘接混合层的机械性能。
其机理可能为PAMAM树枝状聚合物将洗必泰封装在分子内部，并增加了洗必泰在混合层中的停留时间，在老化过程中洗必泰逐渐与PAMAM分离并释放到纤维区域，抑制邻近内源性MMPs的活性。Xiang等的研究中设计了体外完全脱矿牙本质与树脂的50μm间隙模型模拟粘接混合层，将实验样品浸泡于含PAMAM和洗必泰的复合物溶液中，EDS和XRD结果显示完全脱矿牙本质表面形成丰富的类似于牙本质羟基磷灰石的晶体结构。
2.4促矿化仿生肽
近年来研究者们设计制备成本低、易生产的仿生肽来模拟NCPs功能促进牙本质再矿化。2020年Mukherjee等的研究中制备P26仿生肽，TEM结果表明实现了I型胶原纤维再矿化，选区电子衍射（selected-area electron diffraction,SEAD）检测发现纤维内形成了HA晶体。另一项研究制备出新型两亲寡肽，自组装寡肽可以吸引钙离子，诱导非晶态前体的形成，并结合到I型胶原纤维的表面，96 h内形成了厚度为30μm的再矿化层。以上研究提示自组装仿生肽具有I型胶原再矿化潜能，但均未进行牙本质再矿化或牙本质树脂粘接方面的实验。
国内外关于仿生再矿化的材料种类多，这些材料能够实现牙本质胶原纤维内再矿化和羟基磷灰石晶体的有序排列，能够有效提高树脂-牙本质粘接强度，但矿化效率需进一步提高。
3. 其他促牙本质再矿化的改性策略
3.1锌作为添加剂加入粘接系统中
Toledano等在树脂粘接剂中添加10 wt%ZnO颗粒，测试C末端肽浓度以评价24 h、1 w和4 w牙本质中胶原蛋白的降解量。结果显示掺锌的树脂牙本质粘接组胶原蛋白降解量明显低于未掺锌的对照组，这提示锌可以减少牙本质胶原蛋白的降解。该研究者的文献回顾得出的结论是，锌通过结合MMPs的胶原蛋白敏感裂解位点而发挥保护牙本质胶原蛋白的作用。
Sauro等应用ZnO/PAA对钙硅基微填料进一步改性，研制了新的树脂粘接材料。原子力显微镜/纳米压痕测试结果显示，与普通钙硅基微填料和空白对照组不同，应用该新型材料的样品经过1个月和3个月老化后，混合层底部弹性模量较24 h样品的弹性模量明显提高，提示纳米机械性能更佳。2020年Choi等的研究同样证实加入锌的介孔生物活性玻璃纳米粒子能有效提高热循环后树脂牙本质粘接的μTBS值，并能有效降低MMPs活性。
3.2介孔硅材料输送系统
介孔硅材料为多孔结构，有良好的生物相容性。Zhang等制备了胺功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒，将其作为PAA-ACP的载体用于胶原纤维的再矿化实验。PAA-ACP由介孔硅材料储存并转运至胶原纤维表面释放，使其能在胶原纤维网络原位发生再矿化。TEM结果显示实现了胶原纤维内和纤维间再矿化，SEAD检测结果显示胶原纤维内有晶体沉积。
2021年滕笑天等的研究进一步探索了介孔硅材料在提高树脂-牙本质粘接耐久性方面的作用。该研究应用10 mg/mL浓度的介孔硅负载PAA-ACP材料对牙本质进行预处理，30 d后粘接界面的μTBS结果显示该材料对即刻粘接强度无明显作用，但能有效提高老化30 d后的粘接强度。
Szewczyk等采用微波辅助湿法式沉淀法制备了由介孔二氧化硅和磷酸钙组成的5种不同配方的无机材料。表征发现材料中形成不同类型的磷酸钙，例如缺钙羟基磷灰石（calcium defificient hydroxyapatite,CDHA)、磷酸八钙（octacalcium phosphate,OCP)和ACP。此外，该研究制备出微粒型等多种药物剂型方便临床应用，以发挥其矿化潜能。
4. 小结与展望
由于牙本质结构和成分的特殊性，牙本质树脂粘接在临床应用中有一定复杂性。本文回顾了促牙本质再矿化树脂粘接材料提高树脂-牙本质粘接耐久性的研究进展。国内外研究中对实验效果的评价主要包含再矿化效果评价、即刻机械强度评价以及老化后粘接面稳定性的评价，综合讨论检测结果方能评价材料在提高树脂-牙本质粘接耐久性方面的作用。生物活性无机微填料、仿生再矿化材料，以及锌添加剂、介孔硅材料分别以各自的优势在促进牙本质再矿化和提高树脂粘接耐久性方面表现出一定潜力。部分研究对这些新型材料的细胞毒性进行了检测和评价，并得出肯定的结论。这些研究成果使树脂粘接材料和牙本质树脂粘接技术有望实现进一步突破。
回顾目前的研究，各种新型材料较理想的促牙本质再矿化树脂粘接材料仍有一定差距。虽然各种新型材料都具有一定的再矿化作用和提高树脂-牙本质粘接耐久性的作用，但填料的最佳浓度和再矿化材料应用方法仍需进一步研究。此外，再矿化和提高耐久性的效果需要动物实验和体内试验研究进一步证实。
