儿童唾液中蛋白水解酶活性的分析测定
摘要 目的:分析测定儿童唾液中的蛋白水解酶活性,研究其与性别和龋敏感性的关系。方法:采用酶-底物反应法和考马斯亮蓝蛋白含量测定法，分别测定不同性别、不同龋敏感性儿童唾液中亮氨酸氨肽酶、甘氨酰脯氨酸二肽酶和胰酶样蛋白酶的活性及总蛋白含量。结果:①在儿童唾液中仅能测得甘氨酰脯氨酸二肽酶和胰酶样蛋白酶，且其活性明显低于牙菌班中的酶活性（P<0.05）;②唾液中蛋白水解酶活性与儿童性别和龋齿数无关（P>0.05）。结论:儿童唾液中蛋白水解酶的生物学作用尚需进一步研究。
关键词 唾液 蛋白水解酶 乳牙龋 性别
唾液中的蛋白水解酶多来自细菌，也可来源于龈沟液和唾液腺组织本身，其生物学作用包括影响细菌的粘附和集聚，与牙石形成有关等。本文目的是通过比较唾液和菌斑中蛋白水解酶活性以初步判定两者的关系，同时分析唾液中蛋白水解酶在不同性别和不同龋敏感儿童中的差异。
1 材料和方法
1.1 样本的收集
检测对象：在成都市第五幼儿园随机抽取20名5～6岁的儿童，分为有龋组(dmft≥6,n=10)和无龋组(n=10)，两组儿童性别基线相同；再随机抽取儿童20名，男女各10名，每名儿童均dmft≥6。所有儿童六龄牙正萌或未萌，除龋外均无其它口腔疾病，全身健康，无长期服药史（包括使用氟剂）等。
唾液收集：用100 ml清水漱口后，将试管置于受试者舌下，低头约45°,让唾液自行流入试管内，收集约2～3 ml无刺激性全唾液，加盖密封，冰浴下转送-40℃冰箱内贮存。
菌斑收集见参考文献［1］。
1．2 样本处理
对唾液，在低温离心机离心（12000 g，10 min），收集上清液待测；对菌斑的处理见参考文献［1］。
1.3 设备与试剂
见参考文献［1］。
1.4 酶活性和总蛋白含量测定
用荧光底物及有色光底物微量测定法测定菌斑和唾液中3种蛋白水解酶——亮氨酸氨肽酶(LAP)、甘氨酰脯氨酸二肽酶（DPPIV）和胰酶样蛋白酶（TLP）的活性，方法见参考文献［2］，仅在测唾液LAP活性时，取100 μl离心上清液；测DPPIV活性时取50 μl离心上清液，分别加入50 μl底物液，以Tris-HCl缓冲液补足体积至300 μl,混匀；测TLP活性时，取100 μl离心上清液，分别以菌斑液、唾液离心上清液及底物液作空白对照排除干扰。LAP与DPPIV酶活性单位定义为上述反应条件下菌斑液（或唾液）每毫克蛋白水解底物释放1μ mol AMC的量。TLP酶活性单位定义为上述反应条件下菌斑液每毫克蛋白水解1μ mol底物释放出对硝基苯胺的量。
采用考马斯亮蓝蛋白含量测定法测定菌斑和唾液中总蛋白含量，方法见参考文献［2］,测唾液时使用唾液标本对倍稀释液。
1.5 统计分析
菌斑和唾液中3种酶活性及总蛋白含量采用配对t检验进行比较，并对同一儿童唾液与菌斑中酶活性进行相关性分析。不同性别、不同龋敏感性儿童唾液中酶活性及总蛋白含量采用成组设计单因素方差分析进行比较。2 结 果
唾液中可测得DPPIV与TLP活性，未测得LAP活性。唾液中DPPIV、TLP酶活性和总蛋白含量均较菌斑中相应酶活性和蛋白含量小(表1),差别具显著性意义（P<0.05），但相关性分析表明，两者间无明显关系。不同性别、不同龋敏感性儿童唾液中蛋白水解酶活性均无显著性差异（P＞0．05）（表2,3)。
表1 儿童菌斑、唾液中蛋白水解酶活性和总蛋白含量比较（
±s,n＝20）
表2 不同性别儿童唾液中蛋白水解酶活性和总蛋白含量比较（
±s）
