半固态培养基法培养鼠磨牙牙胚的实验观察
［摘要］ 目的：观察体外培养的鼠磨牙牙胚发育过程的组织学变化。方法：用16d胎龄的昆明小鼠下颌第一磨牙牙胚置于RPMI-1640半固态培养基上培养, 常规组织学观察。结果：体外培养的牙胚可由帽状期进入钟状期,出现成牙本质细胞和成釉细胞的分化及前期牙本质的形成。 结论：半固态培养基法培养牙胚可保持其发育过程。
［关键词］ 牙胚； 器官培养； 成牙本质细胞分化发育中的鼠牙胚是研究上皮-间充质相互作用的分子机制的良好模型。鼠牙的发育按特异的时间-空间限制模式发育形成不同的形态结构［1］。牙胚体外培养为研究牙胚发育过程中牙胚形态的发生,成牙本质细胞分化,前期牙本质的生物合成,分泌与矿化机制提供了有利手段。 本研究旨在利用半固态培养基法培养鼠磨牙牙胚,观察体外培养的鼠牙胚发育过程中的组织形态学变化。
材料与方法
1. 实验材料 成年昆明小鼠(湖北医学科学院提供)。RPMI-1640培养基(Gibco,USA);Hepes(Nacalai,Japan);琼脂(Sigma,USA);胎牛血清(Gibco,USA);Bouin\s液。
2. 牙胚的分离 将怀孕16d的昆明小鼠断颈处死(胎龄确定: 以交配后见到阴道栓的当日定为零天胎龄),置75%乙醇中消毒15s。无菌条件下取出鼠胚胎,剪取下颌骨,在体视显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚。
3. 牙胚的体外培养 培养基为RPMI-1640半固态培养基,含青霉素5×104u/L,链霉素50mg/L,维生素C200mg/L,Hepes20mmol/L,胎牛血清20%,琼脂0.5%. 将分离完整的下颌第一磨牙牙胚置于RPMI-1640半固态培养基表面,于37℃,含5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养3,5,7,9,12d,每48h更换培养基一次。
4. 标本制作 分别将新鲜分离的鼠胎下颌及不同培养天数的鼠胎牙胚置于Bouin\s固定液中固定8h,PBS洗涤30min,再用含少量饱和碳酸锂溶液的70%乙醇充分洗涤,直至牙胚的黄颜色全部褪去。常规脱水,石蜡包埋,制作5μm厚连续组织切片,HE染色,镜下观察。结 果
16d鼠胎下颌第一磨牙牙胚的发育处于帽状期晚期(图1)。 成釉器分为三层:内釉上皮,星网状层及外釉上皮。内釉上皮呈单层排列,核为卵圆形,与基底膜毗邻的牙乳头细胞与其它牙乳头细胞类似,核为圆形或卵圆形。 无成熟的成牙本质细胞及前期牙本质出现。
图1 16d鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于帽状期晚期，成釉器分化为三层：内釉上皮（ide),星网状层（sr），外釉上皮（ ode）。（ HE×20）
图2 培养3d后，牙胚继续发育，牙乳头尖明显（↑），出现中间层（si).(HE×20)
图3 培养5d后，内釉上皮细胞分化为前期成釉细胞（pam) ,与基底膜毗邻的牙乳头细胞分化为前期成牙本质细胞（pod）。（HE× 20）
图4 培养7d后，牙乳头尖处成牙本质细胞开始分泌前期牙本质（ pd）。（HE×20）
培养3d标本：牙胚在体外继续发育,成釉器凹陷加深,形成明显的牙乳头尖; 成釉器由三层分化为四层,即在内釉上皮层与星网状层之间又分化出数层细胞,称为中间层,细胞核排列不规则。内釉上皮细胞核伸长呈柱状,单层排列,邻近上皮的牙乳头细胞胞核排列变得较规则(图2)。
图5 培养9d后，成釉细胞（am)与成牙本质细胞（od）均分化成熟，基底膜由前期牙本质（pd）取代。（HE×20）
图6 培养12d后的牙胚有较厚的前期牙本质（pd）形成。（HE× 20）
培养5d标本:内釉上皮细胞已分化为前期成釉细胞,胞核伸长呈梭形,假复层排列,与基底膜毗邻的牙乳头细胞开始分化为前期成牙本质细胞 ,胞核伸长,排列整齐且与基底膜垂直(图3)。
培养7d标本: 在牙乳头尖处, 部分成牙本质细胞开始分泌前期牙本质基质。内釉上皮细胞仍呈假复层排列(图4)。
培养9d标本:整个牙胚冠部的牙乳头外围细胞均分化为成牙本质细胞。在牙乳头尖处,基底膜全部由前期牙本质取代。成釉细胞分化成熟,胞核远离前期牙本质层(图5)。
培养12d标本:有较厚的前期牙本质形成。 牙乳头尖出现分解的细胞核。细胞出现退变(图6）。