变异链球菌葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展
【摘要】 变异链球菌是人类龋病的主要致病菌，葡聚糖结合蛋白是其重要的毒力因子之一。葡聚糖结合蛋白B在变异链球菌的致龋、维持细菌形态、发挥细胞壁生理功能等方面有重要作用，同时其N端具有免疫原性，可应用于免疫防龋。下面就葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展作一综述。
【关键词】 变异链球菌； 葡聚糖结合蛋白B； 龋病
动物试验和流行病学调查均已证实，变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是人类龋病的主要致病菌，其致龋性主要表现在黏附性、产酸性和耐酸性，从而造成无机物脱矿和有机物溶解。对牙面的黏附定植是变异链球菌致龋的首要条件。此过程包括蔗糖依赖性黏附和非蔗糖依赖性黏附，其中葡聚糖介导蔗糖依赖性黏附。葡聚糖结合蛋白（glucan binding protein，Gbp）位于变异链球菌细胞表面，能与菌斑基质中的葡聚糖紧密结合，促进变异链球菌黏附至牙面；因此，Gbp与变异链球菌的毒力有关[1]。Gbp以其发现顺序命名，迄今发现的变异链球菌能合成GbpA、GbpB、GbpC和GbpD等。1994年，GbpB被鉴定、纯化和合成，由于与其他Gbp的生物学特性包括致龋性、免疫原性等方面有显著差异，因此，GbpB引起了学者们的广泛关注。下面就变异链球菌GbpB生物学特性的研究进展作一综述。
1 GbpB的致龋性
大量的证据显示，葡聚糖是变异链球菌主要的细胞外多糖之一，是变异链球菌发挥毒力的关键因子。葡聚糖分为水溶性葡聚糖和非水溶性葡聚糖，其中水溶性葡聚糖主要通过α-1,6-糖苷键将葡糖基彼此相连形成葡聚糖。Gbp能特异性地与水溶性葡聚糖α-1,6-糖苷键区域结合，促进细菌细胞间相互凝集。Banas等[2-3]认为，变异链球菌蛋白，特别是Gbp与葡聚糖的亲和力是促进细菌聚集、菌斑生物膜形成的重要因素。Smith等[4]以gbpB基因中具有免疫原性的序列为基础合成多肽SYI和QGQ，经皮下注射主动免疫S-D大鼠并提取所诱发的IgG和IgA抗体对实验性患龋动物进行被动免疫发现，IgG和IgA具有抗龋效果，即GbpB在变异链球菌致龋性中具有一定的作用。Matsumoto-Nakano等[5]应用gbpB基因缺失突变株对比研究GbpA、GbpB和GbpC致龋性的异同，结果在所有受测试菌株中，gbpB基因缺失突变株BD-1的葡聚糖结合力以及葡糖基转移酶（glucosyl transferase，GTF）活性、疏水性和耐酸性最低。即与其他Gbp相比较，GbpB具有更强的葡聚糖亲和力，对变异链球菌GTF活性、疏水性和耐酸性的影响显著。但GbpB的蔗糖依赖性黏附力与野生株MT8148相似，推测其在变异链球菌致龋毒力中的作用机制与GbpA和GbpC不同，GbpA和GbpC主要通过影响变异链球菌蔗糖依赖性黏附直接发挥致龋性，GbpB则主要利用与葡聚糖的高亲和力，促进变异链球菌细胞间相互凝集，提高变异链球菌GTF活性，改变变异链球菌细胞壁结构，使其具有更高的疏水性和耐酸性，更适于在菌斑生物膜中生存，间接产生致龋作用。
2 GbpB对细菌形态和功能的影响
Smith等[6]通过亲和力层析技术，利用蛋白的葡聚糖结合性质从变异链球菌SJ菌株中鉴定、纯化并合成了GbpB。然而，Mattos-Graner等[7-8]分离临床变异链球菌菌株，对gbpB基因进行克隆和测序，初步的序列分析显示gbpB具有7个特征性亮氨酸拉链序列，没有与GTF或GbpA葡聚糖结合域相似的同源序列。该研究提示，GbpB除了葡聚糖结合特性外，还可能发挥其他的生物学功能；对比其基因分析发现，gbpB基因与编码维持变异链球菌细胞形态、细胞壁完整的功能蛋白相关基因存在联系，该基因序列在革兰阳性菌中是保守的，即该基因所编码的蛋白间具有功能联系，是维持细菌活性所必需的。
进一步的研究发现，GbpB与B群链球菌细胞分裂时必需的多肽蛋白PcsB具有高度同源性，两者均为分泌型细胞结合蛋白，C端具有水解肽聚糖必需的保守半胱氨酸残基，而多肽蛋白pcsB基因表达的下调可导致细菌生长异常和菌体大小改变、形态缺陷。故推测GbpB具有与PcsB相似的生物功能，是细胞壁物质合成和循环的关键成分[8-10]。Chia等[11-12]对变异链球菌压力应激基因进行差异显示反转录PCR筛选发现，在高渗透压和高温条件下，gbpB基因的表达有所增强并与应激基因具有同源性。他们随后构建gbpB基因缺失突变株IDG-60以探讨GbpB在压力条件下的功能，结果再次证实其在变异链球菌维持完整细胞壁和一致的细胞形态中具有重要功能，是压力条件下细菌生长必不可少的。以上研究提示，GbpB可能是变异链球菌的细胞壁结构成分，在维持细胞形态和细胞壁完整中发挥作用。
为了阐明GbpB在变异链球菌细胞功能活动中的具体作用，Mattos-Graner等[13]应用遗传、基因表达和蛋白质相互作用等方法发现，GbpB可与核糖体蛋白质L7/L12形成复合物，该复合物与核糖体中合成肽聚糖的蛋白以及参与变异链球菌细胞分裂的蛋白有相互作用。因此他们认为，GbpB与这两项细胞活动相关。近期有研究显示，gbpB基因缺失可导致变异链球菌细胞表面结构改变。在电镜下的亲代野生株MT8148和各种gbp基因缺失突变株中，唯一在gbpB基因缺失突变株BD-1的细胞壁上存在着目前尚不清楚的壁层结构。变异链球菌具有革兰阳性菌特征性厚细胞壁，主要由肽聚糖和脂磷壁酸构成，而BD-1肽聚糖层显示不清，由此推测GbpB主要的葡聚糖结合受体位于细胞壁上，甚至GbpB可能是具有葡聚糖结合特性的酶，不仅能将葡聚糖结合到细胞上，而且在细胞分裂和维持细胞壁形态方面发挥重要的生物学功能[14]。
3 GbpB的免疫防龋应用
龋病是一种细菌感染性疾病，变异链球菌是其主要致病菌，自20世纪60年代以来各国学者就开始进行其免疫防龋研究，以期利用免疫学手段，通过全身应用防龋疫苗的主动免疫和口腔局部应用防龋特异性抗体的被动免疫来抑制变异链球菌的致龋性，达到抑制龋病发生发展的目的。国内学者分别构建gtfB和gbpA基因的重组质粒，对防龋基因疫苗作了相关研究[15-16]。葡聚糖介导的变异链球菌细菌间黏附和聚集对于致龋性牙菌斑的形成尤为重要，因此通过唾液中的抗体干扰葡聚糖介导的结合过程可有效预防龋病。
在各种涎腺分泌的抗体中，以分泌型Ig（secretory immunoglobulin，sIg）A最多，其作用机制主要为阻抑微生物黏附、抑制细菌酶的活性和溶解细菌等。Childers等[17]指出，口腔中大部分免疫反应是通过黏膜免疫途径实现的，该途径能使保护性sIgA水平达到最高，所以黏膜免疫可作为应用人类防龋疫苗的首选途径。临床研究发现，大量儿童能发生抗变异链球菌GbpB的黏膜免疫应答，提示该蛋白具有重要的免疫原性。
Nogueira等[18]抽取经济收入低、高蔗糖摄取和高变异链球菌感染风险人群中的21对5～13个月大的幼儿进行配对临床研究，其中配对者同龄，1名已受变异链球菌感染，另1名未受变异链球菌感染。变异链球菌的抗原成分主要包括黏附素抗原AgⅠ/Ⅱ、GTF和GbpB，所观察的儿童普遍具有抗变异链球菌IgA，其中GbpB特异性sIgA检出率在受感染组和未受感染组分别为38.1%和76.2%，同时多名儿童的GbpB特异性sIgA占变异链球菌相关sIgA的比例超过50%，这些结果提示GbpB具有更显著的免疫原性。在此基础上探讨唾液抗体对变异链球菌抗原的应答强度时发现，自幼感染变异链球菌的儿童对GbpB的免疫应答强度随年龄增长而增强，原因可能与黏膜免疫系统的逐渐成熟有关，并形成年龄相关性sIgA[19]。
变异链球菌GbpB富含谷氨酸和谷氨酰胺，gbpB基因限制性内切酶多态性分析显示，大部分可变序列集中于GbpB中心区域，保守的功能序列位于N端或C端。N端具有免疫原性，其多个或全部抗原决定簇可作为抗龋亚单位疫苗的靶点[8，3]。机体通过主要组织相容性复合物（majorhistocompability complex，MHC）识别异己，诱发免疫反应。Smith等[4]对GbpB可与人类Ⅱ类MHC结合的多肽区进行分析，构建了与Ⅱ类MHC配体相关的QGQ和SYI两段肽链。特异性QGQ和SYI抗体在S-D大鼠的龋病模型中，均降低了光滑面龋和面龋的发生，SYI相对于QGQ的效果更显著，进一步证实了GbpB的免疫原性。为了寻找更有效的黏膜免疫途径，Peacock等[20]将SYI载入多乳酸-复合乙醇酸交酯微粒，以皮下注射的方式在S-D大鼠中成功免疫黏膜，并诱导抗天然GbpB的免疫应答。
被动免疫作用时间短，而主动免疫诱导变异链球菌抗体与心内膜组织有交叉反应，可能引发感染性心内膜炎。变异链球菌GbpB与口腔内其他链球菌表面蛋白具有同源性，可能影响抗体的效价。因此，虽然防龋疫苗在试验动物中取得了较好的效果，但仍需较长时间验证其安全性、稳定性和有效性，才能用于人体临床试验。