变形链球菌牙面粘附唾液受体的筛选和纯化
摘要 目的:筛选和纯化变形链球菌血清型c(简称变链)的牙面粘附唾液受体。方法:用全唾液包被羟基磷灰石形成实验性获得性膜(SAP),后用1 mol/L NaCl和0.5 mol/L磷酸盐缓冲液分步洗脱,再用Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析对SAP组分进行分离纯化,用细菌粘附实验和细菌粘附竞争抑制实验筛选受体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、淀粉酶活性测定等实验鉴定。结果:IgA降解片段、淀粉酶和分子量为13 kD的蛋白是变链的牙面粘附唾液受体,其中IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白为隐匿受体,淀粉酶组份在变链粘附中具双重作用。结论:变性链球菌对牙面的粘附是变链表面粘接素与多种牙面唾液受体作用的结果。
关键词 变形链球菌 粘附 粘附唾液受体
唾液蛋白对变链球菌(血清型c)(下称变链)在牙面的粘附有重要的调节作用,某些唾液组分吸附于牙面后可与细菌表面粘结素发生特异性结合而促进细菌粘附。因此筛选和纯化变链牙面特异粘附唾液蛋白受体对龋病防治有重要作用［1～3］。本实验旨在分离纯化实验性获得性膜(salivary acquired pellicle,SAP)中的变链粘附唾液受体,并对其理化及生物学性质进行鉴定。
1 材料和方法
1.1 实验性全唾液获得性膜的形成、分步洗脱和盐析
收集一健康成人的非刺激性全唾液300 ml(冰浴保存),20000 g 4℃离心20 min,上清加12 g蛋白质分离纯化用球形羟基磷灰石(HA,北京冶金化工研究所)旋转混匀2 h形成SAP,用1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次备用。用120 ml 1 mol/L NaCl与上述HA旋转30 min2次(6 r/min),离心收集上清液,洗涤3次后,再用120 ml 0.5 mol/L PBS液洗脱2次(条件同前)。分别用硫酸铵沉淀两步洗脱液中所含的全部蛋白组分,沉淀溶解,透析,冻干。
1.2 Sephadex G75层析(2.5 cm×75 cm)
将上述冻干组分分别溶解于0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl中,上样,洗脱,流速20 ml/h,每管收集15 ml, 280 nm测光吸收值,绘制洗脱曲线,分别收集各组分,聚乙二醇20000浓缩透析,4℃保存。
1.3 DEAE-Sephadex A25柱层析(1.5 cm×75 cm)
将Sephadex G75层析组分分别上样,用含0.025 mol/L NaCl的Tris-HCl液洗脱至A280nm=0,再用含0.025～1.2 mol/L NaCl的起始缓冲液(500 ml+500 ml)进行线性梯度洗脱,流速25 ml/h,每管收集5 ml,测ABS280nm值,绘制洗脱曲线,分别收集各组份,透析冻干。
1.4 PAGE、SDS-PAGE和等电聚焦电泳
PAGE、SDS-PAGE均采用Tris-甘氨酸系统,按LKB211Y多相Ⅱ型电泳系统操作手册进行电泳,浓缩胶、分离胶浓度分别为3.75%,7.5%和3.75%,12.5%。等电聚焦电泳按郭尧君的方法进行［4］,pH范围3.5～10。蛋白染色用考马斯亮蓝法,糖蛋白染色用Schiff试剂进行。
1.5 淀粉酶活性测定
用Bernfield的方法进行［5］。
1.6 琼脂糖免疫双向扩散实验
用纯化SAP组分与羊抗人IgA血清(上海生物制品研究所)进行常规免疫双向扩散实验。
1.7 氨基酸组份分析
将纯化蛋白组分冻干样品在精密电子天平(十万分之一,Starus 200 D型)称重,溶于6 mol/L HCl溶液中,110℃水解24 h,真空干燥,日立835-5D氨基酸自动分析仪检测纯化蛋白氨基酸组成。
1.8 细菌粘附实验
细菌粘附实验 用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)标记临床分离的变链血清型c菌株WD9463 A,洗菌后调菌浓度OD550nm=0.52。用纯化的SAP蛋白包被HA(分别以KCl缓冲液和全唾液作为阴性和阳性对照),洗涤后用人血清白蛋白封闭,加入细菌6 r/min旋转1 h,洗3次,进行液闪测量细菌粘附量［6］。
细菌粘附竞争抑制实验 实验步骤基本同前,但菌液浓度为OD550nm=0.62,实验组和阳性对照组用纯化SAP组份(0.01 mg/ml)包被HA,阴性对照组用KCl缓冲液包被,实验组在加入80 μl菌悬液同时加入20 μl纯化SAP组份,对照组则加入20 μl KCl缓冲液。