变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建
变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建
Ⅱ.玻璃纤维质粒分离纯化层析柱重复利用有效性的验证摘要 目的:寻找一种成本较低又可获得较高纯度质粒DNA的方法。方法:根据玻璃纤维质粒纯化层析柱分离纯化核酸的原理，对其使用方法进行改进。使一次性使用的玻璃纤维层析柱能够重复使用。利用分光光度法测定12次重复使用获得的质粒DNA浓度和纯度。进一步利用酶切实验、体外连接和转化实验对重复使用玻璃纤维层析柱获取的质粒DNA进行检测。结果:重复使用玻璃纤维层析柱12次获得的质粒DNA在浓度和纯度上均无明显差异（P>0.05），并且均能被内切酶充分酶切，重新连接后能够很好地被转化。结论:重复使用玻璃纤维层析柱分离纯化质粒DNA的方法能制备出大量高纯度的质粒DNA，不影响质粒的酶切、体外连接和转化，大大降低了成本，在分子克隆和基因免疫研究中具有一定意义。
关键词 柱层析法 质粒DNA 分离与纯化
分离纯化质粒DNA的方法较多，各有其优缺点。在转基因动物、真核细胞转染及DNA外切酶删切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高［1］。一般需采用成本较高的氯化铯-溴化乙锭梯度平衡超速离心法或柱层析洗脱法。为了获取基因免疫所需的高纯度质粒DNA，本实验根据玻璃纤维质粒纯化层析柱分离纯化核酸的原理，对层析柱的使用方法进行改进，力图找到一种成本较低又可获取较高纯度质粒DNA的方法。
1 材料和方法
1.1 菌种
E.coli HB101（含质粒 RSV-BL）(华西医科大学微生物学教研室贾文祥教授提供),E.coli XL-1 blue(四川大学生命学院分子生物学实验中心张义正教授提供)。
1.2 试剂
悬浮缓冲液(suspension buffer），裂解缓冲液（lysis buffer），连接缓冲液（binding buffer），清洗缓冲液Ⅰ（wash buffer Ⅰ），清洗缓冲液Ⅱ，Tris/EDTA(TE）缓冲液，TB缓冲液。RNase A，玻璃纤维质粒分离纯化层析柱和收集管，限制性内切酶EcoRI，T4 DNA连接酶和连接缓冲液（以上试剂均购于德国BM公司）。其余试剂为国产分析纯级（AR）产品。
1.3 质粒RSV-BL的分离纯化
参照文献［2,3］和产品说明书按如下步骤进行：①将甘油保存的菌种HB101（含质粒 RSV-BL）接种于3 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB）培养基中，37℃振荡过夜，取1 ml菌液转种于30 ml含相同抗生素的LB培养基中， 37℃剧烈振荡培养至A600＝1.5～2.0；②取1.5 ml菌液分别装入12只Eppendorf（EP)管中（编号1～12）离心（5000 g×5 min），弃上清、控干；③每管加250 μl含0.1 mg/ml（w／v）RNase A的悬浮缓冲液，在振荡器上振荡10～20 s使菌体均匀分布。④每管加250 μl裂解缓冲液，倒置数次混匀，室温下放置4～5 min。⑤每管加350 μl预冷的连接缓冲液，倒置数次混匀，冰浴5 min后离心（13000 g×10 min）。⑥将玻璃纤维质粒分离纯化层析柱与收集管连接好后将1号管内的上清转移至层析管中，离心（13000g×1 min）；⑦加500 μl清洗缓冲液Ⅰ，离心（13000g×1 min），700 μl清洗缓冲液Ⅱ,离心（13000g×1 min）；⑧将层析管插入干净的EP管中，加100 μl TE缓冲液离心（13000g×1 min），EP管内的液体即为纯化的核酸样品；⑨将2～12号管内上清使用同一个层析柱按步骤⑥⑦⑧重复。每次加样前用TE缓冲液洗柱2次。将所得核酸样品编号1～12号。
1.4 纯度、浓度测定
将各样品在紫外分光光度计上测A260值，计算各管内DNA的量。采用多样本均数间的方差分析(F检验）比较12次重复抽提质粒DNA的浓度差异。测A280值，计算A260/A280比值，判断其纯度。
1.5 酶切分析［5］
每个样品各取2 μl，加16 μl双蒸水,2 μl 10倍酶切缓冲液和2 μl（10 u／μl）的EcoRI内切酶，37℃温育2 h，反应液在65℃温育10 min灭活内切酶终止反应。各取10 μl电泳。照相记录结果。