口腔粘膜肥大细胞介质对成纤维细胞超微结构的影响

〔摘要〕　目的：研究口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中胶原纤维增生的原因。 方法：采用分离纯化人胚口腔粘膜肥大细胞的介质溶液(OMMCC)与体外培养的人胚口腔粘膜成 纤维细胞(OMFb)共同培养，对OMFb进行形态计量分析。结果：OMFb 内粗面内质 网(RER)和线粒体(Mi)体密度、面密质和Mi的数密度增大，RER和Mi的比表面减小。结论：OM MCC可促进OMFb分泌胶原蛋白的功能，肥大细胞可能参与了OSF胶原增生的病理过程。

关键词　肥大细胞；成纤维细胞；形态学；口腔粘膜下纤维化

　　口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)主要表现在粘膜固有层和粘膜下 层胶原纤维增生，其病因尚不清楚。本课题组在OSF早期病变组织中观察到肥大细胞(mast c ell, MC)数量增多，并观察到MC与成纤维细胞(fibro blast,Fb)紧密相嵌，Fb吞噬MC 颗粒的 现象，同时发现吞噬了MC颗粒的Fb分泌胶原蛋白功能活跃〔1〕。为进一步了解MC对F b的作用和MC在OSF中所起的作用，本研究采用分离纯化的MC介质溶液与体外培养的Fb共同培 养，观察MC能否促进Fb分泌胶原蛋白，以探讨OSF胶原增生的机制。

1　材料与方法

1.1　人胚口腔粘膜成纤维细胞(oral mucous fibroblast,OMFb)培养

　　取胎龄3～4月胎儿的口腔颊粘膜，按鄂征〔2〕组织消化原代细胞培养方法进行 OMFb原代培养，经5～6次传代，OMFb自然纯化。

1.2　人胚口腔粘膜肥大细胞内容物(oral mucous mast cell contents,OMMCC)提取

　　按Larence 〔3〕　的肥大细胞提取法，取胎龄3～4月胎儿的口腔粘膜，在Han k液中反复漂洗，剪成0.5～1.0 mm的碎片，加入I型胶原酶1 g/L，透明质酸酶1 g/L(二者 均为Sigma公司产品)，37 ℃消化30 min，尼龙网(150 μm)过滤，残渣再消化一次，滤液离 心(1 000 r/min)10 min去上清，加入RPMI-1 640细胞培养基(Sigma公司产品)，含 体积分数为10%小牛血清(杭州 四季清生物制品厂)、青霉素10 U、链霉素100 g/L，配成有核细胞悬液。用比重为1 0 7 7 g/L的淋巴细胞分离液和比重为1 140 g/L的Ficoll液(均为上海试剂二厂产品)配成比重1 09 3 g/L和1 083 g/L 的两种MC分离液，在离心管中先加入2 ml比重1 093 g/L的分离液，再加 入 2 ml比重1 083 g/L的分离液，然后加入1 ml有核细胞悬液，离心(2 500 r/min，10 min)， 吸 取两种比重分离液间的界面液体，再同法反复离心提纯界面液8次，获取MC悬液。取少许细 胞悬液于体积分数为10%中性福尔马林固定，经甲苯胺蓝、阿尔新蓝、沙红染色和电镜证实 为MC(图1)并计数MC纯度达90%以上，调整细胞密度为2×108个/L，用CPS-1A型超声波粉 碎机 击碎MC，获取OMMCC溶液，即含有肥大细胞介质的溶液，其溶剂为RPMI-1 640细胞培养液。

1.3　OMMCC与OMFb共同培养

　　消化收集第7代的OMFb，调整细胞密度为2×108个/L，以每瓶1 ml的量接种于培养瓶中， 再加入4 ml培养基，37 ℃、体积分数为5%CO2培养24 h后，实验组加入1 ml OMMCC，对照 组加入1 ml RPMI-1640培养基，继续培养。

1.4　OMFb透射电镜制样

　　共同培养120 h后，实验及对照各取3瓶细胞，收集细胞，体积分数为2.5%的戊二醛预固定2 h，10 g/L锇酸后固定1 h，然后按常规超薄切片制样，每标本制两个铜网，透射电镜观察。

1.5　OMFb的形态计量

　　每个铜网随机拍摄5个OMFb，放大10 000倍，每组共拍摄30个细胞，用PC Vision PLus(85型 )图 像分析系统(美国)分别测算OMFb胞浆内粗面内质网(rough endoplasmic reticula,RER)、线 粒体(mitchondra,Mi)的体密度(Vv)、面密度(Sv)，比表面(δ)以及Mi的数密度(Nv)。

2　结　果

　　电镜下实验组OMFb多呈梭形，细胞核较大，常染色质丰富，异染色质较少，胞浆内RER增生 扩张(图2)，线粒体增生(图3)，计量结果如表1。对照组OMFb胞浆内RER、Mi均较实验组少 ，RER亦有扩张但不如实验组明显。