唾液富组蛋白的分离纯化及抗菌活性观察

摘要　目的:探索用电泳技术分离纯化腮腺唾液富组蛋白(HRPs),并观察其抗菌活性。方法:采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE),从健康成人刺激性腮腺唾液中分离纯化3种主要富组蛋白(HRP-1、HRP-3、HRP-5);通过琼脂糖弥散抗菌实验,观察它们对变形链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的抗菌活性。结果:分离纯化出的3种主要HRPs经AU-PAGE及Tricine-SDS-PAGE分析,均为单一的蛋白区带,分子量3～5 kD。3种主要HRPs对变形链球菌和金黄色葡萄球菌均有抗菌活性;HRP-3和HRP-5对大肠杆菌和绿脓杆菌有明显抗菌活性。结论:采用制备性AU-PAGE来分离HRPs,具有分辨率高、操作简便、纯化效果好等特点。HRPs为一组内源性广谱抗菌活性多肽,对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌,包括一些抗生素耐药菌株,都有抗菌作用,可能是口腔抗微生物感染的重要分子,与口腔乃至全身健康密切相关。

关键词　富组蛋白　聚丙烯酰胺凝胶电泳　抗菌活性　琼脂糖弥散抗菌实验

　　富组蛋白(histatins或histidine-rich-polypeptides,HRPs)是一族富含组氨酸的小分子、阳离子同源多肽,仅存在于灵长类动物腮腺及颌下腺分泌物中,现已分离出至少12种人HRPs(HRP1～12)。其中HRP-1、HRP-3、HRP-5为主要成分,称为主要富组蛋白。现有研究表明:HRPs具有多种活跃的生物学功能,其抗微生物作用尤为重要,如抑制、杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。HRPs可能作为一组内源性抗菌肽,参与宿主非免疫防御系统,与多种口腔感染性疾病密切相关［1,2］。尽管近年来国外对HRPs研究较为活跃,但国内尚未见将HRPs各组分分纯制备,并分别研究其生物活性的报道。本实验经制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(acid urea polyacrylamide gel electrophoresis,AU-PAGE),从健康成人刺激性腮腺唾液中分离纯化3种主要富组蛋白,采用琼脂糖弥散抗菌实验,分别测定它们对变形链球菌这一主要致龋菌以及金黄色葡萄球菌等化脓性感染致病菌的抗菌活性。

1　材料和方法

1.1　试剂

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂及蛋白质分子量标准品为Gibco-BRL产品,鸡蛋白溶菌酶、牛血清白蛋白为Sigma产品,营养肉汤粉为卫生部上海生物制品研究所产品,兔中性粒细胞防御素(NP1)由华西医科大学感染与免疫研究室提供,其它试剂为国产分析纯。

1.2　腮腺唾液收集

　　腮腺唾液共100 ml采自4位健康成人(年龄24～32岁,口腔健康,无全身疾病,3个月内未服用抗菌药物)。在受试者腮腺导管开口处放置一金属收集器,舌尖处以5%枸橼酸液刺激唾液分泌。将收集到的新鲜唾液置于冰水浴中,收集完成后立即加入10%等体积乙酸,混匀,100℃水浴加热10 min,冷却后于4℃以5%乙酸透析48 h,10000 r/min离心10 min,取上清冻干。

1.3　HRPs制备

1.3.1　制备电泳　酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)参照Panyim等［3］的方法并作部分修改。所用电泳装置为DYY-Ⅲ28型夹芯式垂直电泳槽(北京六一仪器厂)。12.5%的凝胶(3 mm×100 mm×145 mm)内含5 mol/L尿素,5.4%乙酸,电极缓冲液为5%乙酸,于150 V恒压预电泳4 h。将冻干样品溶于含3 mol/L尿素、5%乙酸的样品缓冲液中,加样后于150 V恒压电泳3 h。电泳后,将凝胶边缘纵切下一条进行考马斯亮蓝R250染色,可见泳动于最前方的成对出现的6个区带(即HRP1～6),以之为标准,分别切下板状凝胶上的HRP-1、HRP-3、HRP-5三条区带。

1.3.2　洗脱电泳　将切下的凝胶条分别置于分子截留量为3 kD的透析袋中,袋内含5%乙酸。透析袋置水平电泳槽内,电极缓冲液为5%乙酸,150 V恒压电泳90 min。收集袋内液体,以蒸溜水透析24 h,冻干后各溶于0.01%乙酸中。

1.4　HRPs的生化分析

1.4.1　AU-PAGE电泳分析　同上述制备性AU-PAGE,但所用电泳装置为mini-protein Ⅱ电泳系统(Bio-rad产品),胶厚0.75 mm,于150 V预电泳90 min,加样后150 V电泳60 min,考马斯亮蓝R250染色。