基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究

　基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究

Ⅰ.变形链球菌pac基因上游区序列测定和分析

摘要　目的:对变形链球菌表面蛋白pac基因上游区进行序列测定和分析。方法:通过应用PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪ABI310对变形链球菌表面蛋白pac基因上游区进行序列测定。结果:测定了pac基因上游区内的517个碱基序列。结论:变形链球菌表面蛋白pac基因上游区序列测定为基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究提供了基础资料。

关键词　变形链球菌　DNA序列测定　pac基因

　　龋病是一种细菌感染性疾病,变形链球菌与人类龋病密切相关。目前认为免疫学预防措施是控制龋病的手段之一［1］,并已研究了一系列防龋疫苗,如灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程重组疫苗等。目前存在的问题是,大多数疫苗由非肠道途径应用并引起血清IgG反应,而大多数病源微生物都是通过粘膜屏障而致病。因此,研究替代性接种途径以诱导保护性粘膜免疫应答是非常必要的［2］。本研究旨在运用分子生物学和遗传工程技术,制备带有变形链球菌表面蛋白的抗原结构基因的重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗,进行实验动物口腔人工自动免疫。本文将报告变形链球菌MT8148表面蛋白pac基因的上游区序列测定和分析,以进一步获得变形链球菌表面蛋白的结构基因资料。

1　材料和方法

1.1　菌种与培养

　　E.coli MC1061(含质粒pPC41,日本福冈大学Koga教授赠送)。取-70℃保存的菌种划线于LB-Amp平皿上,37℃培养过夜。挑取单菌落于5 ml LB-Amp液体培养管中,37℃摇床培养8 h。取0.5 ml培养物接种于LB-Amp液体培养基中,37℃摇床培养12～16 h(OD660=1.0～1.5)。4℃下,3000 r/min离心收集菌体。

1.2　Qiagen plasmid kit提取和纯化质粒pPC41

　　采用Qiagen plasmid kit(Qiagen公司)试剂盒提取和纯化质粒。将已收集的菌体重悬于缓冲液 P1(含10 mg/ml Rnase A)。加入缓冲液 P2,轻柔混匀,室温放置5 min,加入缓冲液 P3,轻柔充分混匀,冰浴20 min,4℃下,20000 r/min离心15 min,将上清移入一灭菌试管中。将Qiagen Tip 100柱用缓冲液 QBT 4 ml平衡,并依靠重力将缓冲液 QBT排尽。将离心获得的上清加样于柱中,依靠重力将上清过柱。加入缓冲液 QC 10 ml洗柱两次。加入5 ml 缓冲液 QF溶解洗脱柱中吸附的质粒DNA。将洗脱液加3.5 ml异丙醇充分混匀,4℃,15000 r/min离心30 min,去除上清,2 ml 70%乙醇洗涤沉淀,室温放置至乙醇完全挥发后,用0.5 ml双蒸馏水溶解沉淀,-20℃保存。

1.3　核苷酸序列测定

　　以M13/pUC测序通用引物5\GTAAAACGACGGCC

AGT3\(上海生工公司合成),结合纯化质粒pPC41为模板,用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒,在PE公司6400型PCR仪上进行测序反应,模板用量约1 mg,引用物6 pmol。反应产物经纯化后用ABI公司310 DNA序列分析仪进行序列测定。

2　结　　果

　　应用Qiagen plasmid kit获得了适用于测序的高纯度pPC41质粒DNA。

　　应用通用引物对pPC41质粒中的插入片段进行了测序,共测517个碱基对(图1)。

3　讨　　论

　　龋病是一种细菌感染性疾病。预防微生物引起的传染病的一个重要生理基础是粘膜免疫系统。分泌型IgA(SIgA)是粘膜免疫应答中最重要的因素。SIgA能有效地防止微生物在粘膜表面定居和对宿主细胞的侵袭。在肠道,微生物首先与肠道相关的淋巴组织(GALT)作用,刺激产生IgA的前体B细胞,这些前体细胞转移至肠系淋巴结、胸导管,然后通过体液循环分布到体内各个分泌组织,包括肠道和呼吸道的固有层,分化为成熟的浆细胞,分泌抗原特异性SIgA。非肠道途径使用疫苗不能有效地激发粘膜SIgA应答,所以对只定居在粘膜表面而不侵袭到深层组织的微生物免疫效果不佳。口服疫苗,尤其是减毒的口服活疫苗,因为能携带抗原至GALT,已证实能有效地激发特异性的SIgA应答。

 

 CNA NGC TTG CAT GCN TGC AGT AAC TGC NAC TNG ATA CTA AAA ATT CAA ATC CAC AAG TCA