大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Bcl-2，Bax的表达及其意义
摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Bcl-2和Bax的表达情况，探讨两者在牙髓炎病理变化中的作用。方法：利用 SD大鼠的下颌第一磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，用免疫组织化学染色的方法研究Bcl-2和Bax的表达及其意义。结果: 正常牙髓中Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，牙髓中央区域弱阳性, Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，牙髓中央区域阳性。在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，Bcl-2的表达在相应部位弱于Bax。在炎症牙髓中炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性, Bax在炎症牙髓中着色较均匀。结论：成牙本质细胞凋亡与Bcl-2和Bax的表达量有关，正常牙髓中存在细胞凋亡，这与该部位Bax表达量较高有关；Bcl-2和Bax是牙髓炎时炎细胞凋亡的重要调控因素之一。
bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2）基因的缩写形式，是最早在人类细胞中发现的凋亡调控癌基因。Bax是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因。研究表明，Bcl-2的抗凋亡作用及Bax的促凋亡作用是通过二聚体的形式来实现的，两者在组织细胞中的表达量与细胞凋亡的调控紧密相关［1，2］。正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞调亡［3］，那么Bcl-2和Bax在其中有什么作用，本文就此作一报道。
1 材料和方法
1.1 动物模型的制备
参照余擎报道［4］，选用LPS法的模型。
1.2 免疫组织化学染色
参照德国宝灵曼公司SP免疫组化试剂盒的方法，脱蜡至水后行微波抗原修复，用30ml/L H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，100ml/L正常山羊血清（多抗）封闭37℃20min，倾去血清，分别滴加1:50的Bcl-2和Bax多抗工作液，4℃过夜。次日复温1h，滴加1:100的生物素标记二抗37℃30min，再滴加1:100的辣根酶标记链霉卵白素37℃30min，最后DAB显色15min，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。（所用试剂均购自北京中山生物技术有限公司，各步骤间均用0.01mol/L的PBS振洗，阴性对照用PBS代替一抗。）
2 结果
正常牙髓中Bcl-2和Bax均有表达，两者均定位于细胞的胞浆，Bcl-2在部分胞膜上也有表达，表现为棕黄色着色。Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，在牙髓中央区域弱阳性表达（图1）； Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，在牙髓中央区域呈阳性表达（图2）。从阳性染色的强度来看，两者在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，尤其是成牙本质细胞层，而Bcl-2的表达在相应部位又弱于Bax。
图1 正常牙髓中Bcl-2的表达 (10×10)
图2 正常牙髓成牙本质细胞Bax表达阳性 (40×10)
通过LPS化学诱导，各实验组呈现出较典型的牙髓炎症性组织病理学改变，从穿髓点以下依次出现坏死区、炎细胞浸润区、纤维包饶区和充血反应区。在炎症牙髓中我们观察到，炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性（图3）；Bax在炎症牙髓中的表达也是阳性，但着色较均匀（图4）。此外，我们还注意到在1d组、3d组、5d组、7d组中，Bcl-2和Bax在炎症区域的表达是逐渐减弱的。
图3 Bcl-2在炎症牙髓中的表达 (10×10)
图4 Bax在炎症牙髓中的表达 (10×10)
3 讨论
bcl-2是一种凋亡抑制基因，其编码的蛋白能抑制细胞发生凋亡，延长细胞的存活时间。Bcl-2蛋白抗凋亡作用的机制尚不明确，但至少与以下因素有关：①Bcl-2蛋白羧基端19个氨基酸构成疏水的跨膜整合区或称信号锚定顺序（signal anchor sequence）是Bcl-2发挥作用的结构基础。②Bcl-2通常以同源二聚体或异源二聚体的形式发挥作用。Bcl-2可与同家族的Bax、Bcl-x(s)、AL基因、Bad及非同家族的Bag-1形成异源二聚体。③Bcl-2的作用受其它基因的影响，如p53、c-myc等。Bax的基本生物学功能是促进细胞凋亡，其促凋亡作用也是通过同源二聚体或异源二聚体来调节的，其促凋亡作用受Bcl-2、Bcl-x(l)和Bad调节，均以二聚体形式发挥作用。Bcl-2和Bax的表达具有一定的组织特异性和细胞分化阶段特异性。Bcl-2基因在哺乳动物胚胎组织中广泛表达，在人成熟组织中主要表达于长寿细胞和/或具有增殖活性的细胞，Bax的表达则更为广泛