大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡
摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中细胞凋亡现象，探讨细胞凋亡在牙髓炎病理变化中的作用。方法：16只SD大鼠的磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，分别于1d、3d、5d、7d取材，常规制备石蜡切片，行HE染色和TUNEL法检测。结果：正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞均发现有凋亡细胞；炎症牙髓中炎细胞聚集区未发现典型的凋亡细胞，而在其周边发现有较典型的凋亡细胞，在其正常组织中也有散在的凋亡细胞存在。结论：正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞凋亡，细胞凋亡在牙髓炎的转归和预后方面可能有一定的作用。
细胞凋亡是多细胞生物体中广泛发生的正常的细胞生理死亡过程，用于清除不需要的细胞或对自身有害的细胞。恶性肿瘤、自身免疫性疾病、获得性免疫缺陷综合征、退行性变等许多人类重要的疾病都与细胞凋亡机制异常密切相关［1］，随着凋亡的中性粒细胞被吞噬清除现象的发现，炎症与细胞凋亡间的关系也越来越受关注。近两年法国学者发现正常牙髓中存在细胞凋亡［2，3］，那么作为我国口腔内科的常见病——牙髓炎，细胞凋亡现象是否存在？与牙髓炎的发生发展有何关系？现将本研究的初步结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 动物模型的制备
参见余擎的报道［4］，选用LPS法建立的牙髓炎模型。
1.2 HE染色组织中凋亡细胞的识别
在HE染色的组织切片上光镜检查能识别典型的凋亡细胞，其形态特征为：①胞浆弱嗜伊红（嗜酸性变）；②细胞收缩变小，可与周围细胞分离；③核染色质沿核膜浓缩呈环状或新月状和（或）核片段化，且至少具备两个以上条件方可确定为凋亡细胞［5］。
1.3 原位末端标记
参照德国宝灵曼（Boehringer Mannhelm）公司1998年细胞凋亡试剂盒的说明书,具体步骤如下：切片脱蜡至水，蛋白酶K室温30min，加TUNEL反应液37℃60min，加标有碱性磷酸酶的抗荧光素抗体37℃30min，再加NBT/BCIP显色15min，伊红复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照用标记液代替TUNEL反应液。
2 结果
HE染色镜下能观察到正常牙髓的成牙本质细胞中有一些较典型的凋亡细胞，在牙髓细胞中也能发现这种形态的细胞，且多位于牙髓的外围。炎症牙髓中HE染色未能区分出典型的凋亡细胞。TUNEL检测法中细胞核2/3为蓝紫色颗粒，核固缩，细胞呈圆形者即为凋亡细胞。正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞中均有一些阳性细胞，且越靠近牙髓外周阳性细胞就越密集（图1，2）。在炎症牙髓中1d组的阳性细胞分布与正常牙髓相似，只是越靠近穿髓点阳性细胞越多；3d组、5d组、7d组的阳性细胞随着时间的推移逐渐减少，5d组和7d组穿髓点下方出现大片的坏死区和炎细胞高度密集区，这些部位都呈较均匀的深蓝色，无凋亡细胞的形态，为非特异性着色；在非特异性着色与根髓正常组织的交界处可见一些阳性细胞（图3），呈弧型围绕非特异性着色区，可能为一些炎细胞和成纤维细胞，其下方的正常组织阳性细胞增多（图4）。所有的阴性对照标本均未着色．
图1 正常牙髓中成牙本质细胞TUNEL阳性 (40×10)
图2 正常牙髓冠髓外周有散在的TUNEL阳性细胞 (40×10)
图3 5d组，炎症牙髓在坏死区与正常组织交界处有凋亡细胞 (40×10)
图4 7d组，在炎症牙髓炎症下方牙髓中凋亡细胞增多 (40×10)
3 讨论
有核细胞一方面存在受遗传控制的细胞分裂、增殖的功能，另一方面也具有使细胞主动发生死亡的机制，即细胞凋亡（apoptosis）, 又称细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD），二者之间的动态平衡维持着多细胞组织的内环境稳定。因此，细胞凋亡是生命过程中不可缺少的组成内容，是多细胞生物籍以存活的需要，贯穿于生物全部生命活动中。近来法国学者Vermelin等发现正常的牙髓组织中存在细胞凋亡，其主要分布于牙髓的周边，尤其是成牙本质细胞下层，且冠髓明显多于根髓，但在成牙本质细胞层却未见阳性细胞