大蒜、枸椽酸和双氧水对口腔厌氧菌的超微结构影响

　　提　要　目的　探讨大蒜、枸椽酸和双氧水对口腔厌氧菌的杀菌机制。方法　采用透射电镜，观察药物对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的直接影响。结果　观察到3种药物对各种细菌作用的超微结构改变不尽相同，药物在37℃作用15分钟后，可破坏细菌的胞壁结构，可见壁破裂、变薄或消失，胞浆变性，核糖体聚集成块状沉淀，或胞浆内容物溶解呈空泡变性等。结论　观察药物对细菌的超微结构影响，可为研究口腔厌氧菌的生理、病理关系以及药物的解毒杀菌机制等提供实验依据。

　　关键词　大蒜　　枸椽酸　　双氧水　口腔厌氧菌　　超微结构

　　大量研究表明牙周病是一种感染性疾病，革兰阴性厌氧菌是其重要病原菌，一些抗菌药物或防腐消毒剂如枸椽酸、双氧水和大蒜等处理牙周袋或病变根面，在牙周病领域受到高度评价和广泛应用〔1～3〕。但它们的杀菌机制,特别是对口腔厌氧菌超微结构的直接影响却报道极少。本研究采用透射电镜观察它们对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的超微结构影响，旨在探讨药物解毒杀菌机制。

材料与方法　　

　　1.　实验菌株和培养条件

　　选择与牙周病关系密切的3种口腔厌氧菌，为标准化起见，均采用国际参考菌株作为试验菌株，包括：

　　核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, 简称Fn） ATCC 10953；

　　牙龈卟啉菌（Porphyromonas gingivalis, 简称Pg） ATCC 33277；

　　脆弱类杆菌（Bacteriodes fragilis, 简称Bf) ATCC 25285。

　　各菌株活化鉴定后，分别接种于CDC厌氧血琼脂平皿上，其主要成分为胰蛋白胨、大豆胨、氯化钠、酵母浸出粉、L—半胱氨酸、氯化血红素、维生素K1和琼脂，放入厌氧手套箱中，36℃厌氧培养72小时，用棉签将细菌移入生理盐水，洗涤2次（3000rpm, 离心10分钟）， 弃去上清液，细菌沉淀备用。

　　2.　实验药物

　　大蒜：取去皮新鲜大蒜（山东省龙口市复发中记工业园）1000g，用双蒸水选2遍，粉碎机榨汁,4层消毒纱布过滤，再用滤纸过滤，得淡黄色澄清的大蒜汁（pH5.5),放入4℃冰箱备用。

　　50％枸橼酸：天平称取药用枸橼酸50g，加入100ml双蒸水（pH1.0)

　　3％双氧水：上海桃浦化工厂（沪卫药准字95第0490号—098）

　　3.　药物处理

　　洗涤干净的3种纯菌，当即用生理盐水制备成109／ml的细菌悬液，每种菌分装4根试管，每管菌液10ml，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，在细菌沉淀中分别加入50％枸橼酸、3％双氧水和大蒜汁10ml，对照管加生理盐水10ml，37℃下混匀，处理15分钟。

　　4.　电镜标本制备

　　上述药物处理组和对照组菌液，3000rpm,离心10分钟，弃去上清液，将细菌立即放入2％戊二醛前固定，二甲胂酸钠缓冲液漂洗，1％锇酸后固定，酒精系列脱水后常规包埋，作超薄切片，在HITACHI　H—500透射电镜下观察并摄片。

结　　果

　　1.　实验菌株特性和扫描电镜下形态

　　3种国际参考菌株进行复苏、纯培养后，经菌落形态、菌体染色及生化反应鉴定，结果均符合VPI厌氧菌手册鉴定特性〔4〕，对照组3种细菌的超薄切片，在透射电镜下可观察到细胞壁（CW）和细胞膜（CM）：因为这3种菌均为G-菌，细胞壁结构较为复杂，可见2～4个致密层及中间透明区结构，Pg菌表面还可见到毛状外膜；细胞浆和核区（P，Nr）：大部分细菌在均质结构中可见散在的核糖体颗粒，有的细菌在中心部分可见核区，无核膜核仁(图1～3）。

　　2.　药物处理后细菌的超微结构变化

　　黑色的Pg经50％枸橼酸处理后变为淡褐色，经3％双氧水处理，黑色的Pg很快变为白色，并可见大量气泡，而经大蒜汁处理Pg仍为黑色，Fn和Bf在3种药物处理前后颜色未见明显变化。在透射电镜下的超微结构改变（表1）（图3～12）。

表1　药物处理组的细菌超微结构变化

 

组别细菌FnPgBf大蒜组胞壁失去原有结构而明显变薄，大部分胞浆溶解消化，少数变性，可见黑色沉淀（图4）许多细菌破碎崩解，有的胞浆变性，有的出现空泡（图5）胞壁消失或变薄，胞浆高度变性，核糖体聚集成深黑色团块沉淀，少数细胞内容物破坏出现空泡（图6）50％枸橼酸组

　　细胞变形，胞壁变薄失去原有结构，有的胞浆内可见黑色沉淀，有的消化呈空泡（图7）可见细胞集聚融合成片和空泡变性，有些胞浆内可见黑色沉淀颗粒（图8）大部分胞壁不完整，破裂呈不连续状态，胞浆内可见大量颗粒样黑色沉淀（图9）3％双氧水组

　　胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆内容物溶解漏出呈空泡，少量变性（图10）细胞可融合聚集成片，胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆萎缩，出现较多空泡（图11）可见细胞破裂，部分胞浆内容物溶解呈空泡（图12）