大鼠牙周组织中肿瘤坏死因子—α受咬合力丧失影响变化的研究

　　提　要　目的　检测咬合力在正常及丧失状态下，大鼠牙周细胞TNF—α的动态表达，初探TNF—α在牙周组织改建中的分子机理。方法　采用HE染色和免疫组化的方法，观察牙周形态变化以及牙周组织中TNF—α蛋白表达。结果　咬合力丧失引起牙周膜结构紊乱、牙槽骨吸收。同时，牙周细胞中TNF—α表达较正常咬合力时明显增强。结论　咬合力丧失，促使TNF—α明显增多。本实验从分子水平探讨了牙周组织改建的机理；揭示了牙周组织结构与功能在改建中的一致性。

　　关键词　咬合力　　肿瘤坏死因子—α　　牙周组织改建　　免疫组化

　　肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF)是一种重要的细胞因子，有着广泛的生物学活性。TNF—α是重要的破骨细胞活化因子之一，它和其他细胞因子（如IL—1β、IL—6）一起，共同参与着骨的改建。

　　本实验研究了大鼠咬合力丧失对牙周组织的形态学影响以及TNF—α在牙周组织中表达的动态变化。初探了TNF—α在不同咬合力作用下对牙周组织改建影响的分子机理。

材料和方法

　　动物模型

　　选用80只250g±20成年雄性Wistar大鼠，随机等量地分为对照组（正常咬合力）和实验组。实验组拔除左侧上颌（B区）所有磨牙。这样，实验组的D区磨牙因丧失对颌牙而构成咬合力丧失的动物模型。两组动物分别在实验后6小时、1天、2天、3天、1周、2周、3周和4周各处死5只，共16组。

　　组织标本制备

　　实验动物采用4％多聚甲醛心内灌注的方式行内固定。取出下颌相应骨段，保留磨牙区，置于4％多聚甲醛中巩固固定6小时。将标本移至EDTA中脱钙2周。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。标本厚5μm，裱于经硅化处理的玻片上。

　　实验方法

　　1. 组织形态学　取相应切片进行苏木素一伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察牙周形态变化，并用显微标尺对牙周膜宽度进行测量。

　　2. 免疫组化　TNF—α单克隆抗体（四军大病理教研室提供），ABC试剂盒（美国Vector公司）。常规免疫组化染色，DAB显色。设已知有TNF—α表达的应激大鼠脾组织作阳性对照，以封闭血清代替一抗作阴性对照。

　　图像分析与统计学处理

　　采用MIAS—2000型图像分析仪，对实验组和对照组各时间点牙周膜染色强度进行测量。每个标本均选第一磨牙牙根为观察对象。结果用t检验进行统计学分析。

结　　果

　　组织形态学

　　1. 对照组（正常咬合力）大鼠牙周膜结构致密，纤维排列有序，成纤维细胞胞核的方向与之一致。牙槽骨骨壁较平，表面衬以连续排列的扁平成骨细胞。

　　2. 实验组（咬合力丧失）2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱；牙槽骨骨壁凹凸不平，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。3周、4周时，牙周膜结构更加紊乱；牙槽骨仍凹凸不平，但牙槽骨中的破骨细胞数量减少。

　　免疫组化

　　1. 对照组大鼠牙周膜成纤维细胞（PLF）能稳定表达TNF。其免疫阳性信号位于胞浆内。牙槽骨成骨细胞未见TNF—α明显表达。

　　2. 实验组牙周膜表达TNF—α的阳性强度明显高于对照组（表1），且表达有一定的时间规律：3天后出现明显变化，随后阳性强度逐渐增大，2周达最大值，然后逐渐减小，4周时基本恢复正常。实验组2周时观察到成骨细胞中TNF—α明显表达。

表1　对照组和实验组不同实验时间牙周膜TNF—α免疫组化染色灰度差值表

 实验时间对照组（正常）实验组（丧失）6小时14.373914.61481天14.297315.02872天14.111716.46353天15.381224.22171周14.865430.05602周14.654141.98323周15.008530.76484周14.892316.4741

　　（说明：其中*为两组比较的概率值。“*”表示P<0.01，有显著性差异。无星号者，P>0.05，无显著性差异。）

讨　　论

　　本实验HE染色观察到，咬合力丧失引起牙周膜结构紊乱，牙槽骨吸收。免疫组化结果显示，正常咬合力状态下大鼠牙周膜成纤维细胞（PLF）能稳定表达TNF—α。咬合力丧失后，牙周膜表达TNF—α的强度明显增强，且牙槽骨（靠近骨面处）成骨细胞中2周时表达也明显增强。本实验提示，咬合力丧失，诱导PLF和成骨细胞产生了明显增多的破骨因子TNF—α。