大鼠牙周膜I型胶原mRNA原位杂交方法的建立

　　【摘　要】　目的　建立检测大鼠牙周膜内Ⅰ型胶原mRNA表达的原位杂交方法。方法　选用大鼠为对象建立动物模型，采用地高辛标记的寡核苷酸探针的原位杂交方法。结果　阳性对照组，用有活跃Ⅰ型胶原mRNA表达的大鼠皮肤标本进行原位杂交，得到了理想的阳性结果；各阴性对照均未检测到信号。标本的信号随着PK浓度的升高而升高，大鼠牙周膜Ⅰ型胶原mRNA的表达很强。结论　所建立的原位杂交方法敏感性高，特异性高。

　　【关键词】　牙周膜；Ⅰ型胶原；原位杂交

　　牙周膜（Periodontal Ligament, PDL)是牙周组织的主要结构之一，其中胶原又是PDL的主要成份。牙周胶原在牙周改建中起着要作用。PDL中有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ型胶原，其中Ⅰ型胶原最多，占胶原量的85％〔1，2〕。可以说牙周膜的改建在很大程度上取决于Ⅰ型胶原的改建。Ⅰ型胶原给PDL提供抗张强度，使牙齿能承受咀嚼压力。已有学者用免疫组化法定位了Ⅰ型胶原在PDL中的表达〔3〕。20世纪90年代，学者们开始用分子生物学的手段来研究牙周胶原的代谢，所涉及的方法有原位杂交（In Situ Hybridization, ISH),RNA转移斑点法等〔4．5，6〕。其中最常见的是原位杂交。ISH是将组织化学与分子生物学技术相结合用以检测和定位核酸的技术。它利用了核酸分子的碱基互补配对性，用一标记的核酸探针去检测与之很高，可以在基因水平和转录水平进行检测。

　　用ISH法可以在转录水平特异性地检测各种生理及病理情况下牙周膜内Ⅰ型胶原mRNA表达的变化情况，为牙周膜的相关研究提供了一种有效、可靠的检测方法，但目前国内尚未见关于用原位杂交（ISH）法检测牙周膜内Ⅰ型胶原mRNA表达的报道。本实验以雄性Wistar大鼠为对象，建立了检测大鼠牙周膜内Ⅰ型胶原mRNA表达的原位杂交方法，其基本步骤也适用于其它种属的动物及其它mRNA。

材料与方法

　　1.　标本制备

　　选用80只体重为250±20g的雄性Wistar成年大鼠，给大鼠注射过量麻药后，左心室用4％多聚甲醛灌注。解剖出下颌骨，仅保留磨牙区骨段，浸泡于4％多聚甲醛中再固定6小时。将标本移入脱钙液（含0.7g/L EDTA， 8mg/L 酒石酸钠钾，0.14g/L 酒石酸钠，99.2ml/L HCL）中4℃保存两周。洗净脱钙液，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。每个下颌骨标本切3张组织切片，厚度一律控制为5μm，裱于经硅化处理的玻片上。

　　2.　探针的制备与标记

　　采用长度为39个碱基的反意义寡核苷酸探针，序列为：5’-GCC GTC TTC AGA GCT GTA AAC GTG GAG GCA AGG AGT CCC-3’。用地高辛寡核苷酸加尾试剂盒将地高辛精11-dUTP标记到寡核苷酸的3’末端。

　　3.　原位杂交

　　常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水（Depc水）；0.2MHC1中浸泡20分钟，Depc水洗；加入50μg/ml蛋白酶K， 37℃孵育20分钟，PBS洗；0.2％甘氨酸PBS溶液浸泡20分钟，PBS洗；4％多聚甲醛的PBS溶液后固定20分钟，PBS洗；0.25％乙酸酐、0.1M三乙醇胺溶液浸泡10分钟，PBS洗；酒精梯度脱水，空气中干燥1小时；准备杂交缓冲液：0.125mg/mlSSDNA、0.25mg/ml tRNA、50％甲酰胺、12.5％硫酸葡聚糖，104℃干浴10分钟后自然冷却到室温，再加入适量DTT，备用；将标记好的探针用探针稀释液配至10μg/ml，再与杂交缓冲液以1∶5的比例混匀成杂交液；滴加预杂交液，42℃孵育2小时；倾去预杂交液，滴加杂交液，加盖玻片，42℃孵育16小时。

　　4.　杂交信号的检测

　　将玻片移到预热到37℃的甲酰胺溶液中摇动浸洗5分钟，至盖玻片脱落；用2×SSC在37℃水浴中振动清洗两次（15分钟及30分钟）；用0.2×SSC在47℃水浴中振动清洗两次（15分钟及30分钟）1×马来酸缓冲液洗10分钟，室温；滴加阻断剂，30分钟，室温；滴加新鲜配制的1∶1000抗地高辛碱性磷酸酶，37℃中孵育3小时；马来酸缓冲液洗后滴加检测缓冲液；滴加1∶50的NBT/BCIP，25℃避光显色13小时，自来水冲洗；2％甲基绿复染；切片干燥，二甲苯透明，加拿大胶封片。