大鼠牙胚组织发育过程中釉原蛋白mRNA的表达

〔摘要〕　目的：观察釉原蛋白（Am）基因在大鼠牙胚组织发育过程中的表达。方法：采用原位杂交的方法，检测大鼠孕期17、18、19 d和出生后1、3、5、7、9 d牙胚中成釉细胞Am mRNA的表达。结果：从出生后1 d至出生后9 d大鼠第一磨牙牙胚中均检测到Am mRNA的表达，其中出生后第5 d表达最高，成釉细胞分泌完成后Am 的表达下降。成牙本质细胞在发育的任何时期均未见到Am 的表达。结论：釉原蛋白基因的转录只发生在牙胚发育的早期，前成釉细胞极化阶段和成釉细胞分泌阶段；发育成熟的釉基质中没有釉原蛋白。成牙本质细胞不表达釉原蛋白基因。

关键词　釉原蛋白；牙胚；大鼠；原位杂交

　　釉原蛋白（amelogenin，Am）是一族在牙釉质形成过程中的组织特异性的细胞外基质蛋白，它是由来源于原始口腔上皮的、特异性的上皮细胞——成釉细胞合成和分泌的［1］。釉原蛋白占釉质蛋白质的90%，其组成成分不是单一的，至少有9种成分，Mr 20 000～27 000，它对釉质的形成至关重要。釉原蛋白具有较复杂的生物学特性，目前以大鼠为模型探讨釉原蛋白在牙胚发育的具体时期的表达未见报道。本研究利用标记的釉原蛋白探针，对大鼠牙胚不同发育阶段釉原蛋白的表达进行原位杂交研究，探讨其生物学意义，为进一步研究釉质的生物矿化机理以及釉原蛋白的功能提供基础。

1　材料和方法

1.1 标本的制备

　　 大鼠孕期为20 d，选择怀孕17、18、19 d（以E17、E18、E19表示）、出生后1、3、5、7、9 d（以PN1、PN3、PN5、PN7、PN9表示）的Wistar 大鼠，置体积分数为75%乙醇中消毒10 s，颈部横断，鼠胚头用Hank 液冲洗，取出下颌骨沿矢状切开，去除皮肤，浸入新配制的40 g/L多聚甲醛 4 ℃ 固定过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片（厚8 μm）。玻片事先用APES处理，4 ℃保存备用。

1.2 探针及标记

　　用我们已克隆出的大鼠Am基因（ Am cDNA 660bp）标记探针，探针的标记按照Dig-DNA Labeling Kit方法进行（Boehringer Mannheim Biochemical产品）。

1.3 原位杂交

　　石蜡切片经常规脱蜡至DEPC水及0.1 mol/L PBS(pH7.4)后,分别用0.2 mol/L HCl和蛋白酶K 处理, 梯度酒精脱水后室温干燥组织片。42 ℃杂交20 h后，分别经2×SCC、1×SCC、buffer Ⅰ、bufferⅡ依次充分洗涤。正常羊血清封闭50 min后,滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体30 min(37 ℃)，经bufferⅠ、bufferⅢ洗涤后用显色液（bufferⅢ 1000 μl、左旋米唑0.24 mg、NBT 4.5 μl及BCIP 3.5 μl）暗处显色，TE液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH8.0) 终止反应,常规脱水透明封片。

2　结　果

　　在第一磨牙帽状期（E17）和早期钟状期（E18、E19）的前成釉细胞中未见到Am mRNA的表达。最早观察到Am基因mRNA表达的是在PN1（钟状期）的前成釉细胞中(图1)。PN3（钟状期中期）在部分正在极化的成釉细胞中可见到表达，与　PN1相比在成釉细胞中的表达逐渐升高，成牙本质细胞中未见到表达(图2)。PN5（晚期钟状期）成釉细胞中 mRNA表达信号最强(图3)。PN7:在完全极化的成釉细胞中的表达下降。PN9:牙釉质与前期牙本质形成期，在成熟的、分泌后期的成釉细胞中可检测到比较弱的信号表达。成熟釉质和牙本质中均未检测到表达信号(图4)。

图1　PN1开始检测到Am mRNA的表达

图2　PN3 Am mRNA表达信号增强

图3　PN5 Am mRNA表达信号最强

图4　PN9成熟釉质和牙本质中均未检测到Am mRNA表达信号

3　讨　论

　　牙胚的发育是一个复杂的、连续的生物学过程。在这一过程中，上皮与间充质相互作用，诱导牙胚组织细胞的增殖和分化，大鼠第一磨牙牙胚是研究成牙本质细胞和成釉细胞分化的良好模型，因为它包含了未分化的前期成牙本质细胞和内釉细胞以及正在分化的、尚未成熟的、成熟的成牙本质细胞和成釉细胞。同时它也是研究釉质矿化的良好模型，釉质矿化的整个过程都可以观察到。