大鼠牙髓中谷氨酸能神经纤维的定性研究
摘 要：目的：为了明确牙髓中有无谷氨酸(Glutamate,Glu)能神经纤维的存在，以探讨牙痛信息传递机制。方法：自大鼠牙髓腔内注入逆行追踪剂辣根过氧化物酶—麦胚凝集素(HRP-WGA)，数天后取三叉神经节做HRP呈色Glu免疫组化反应，观察支配大鼠牙髓的初级感觉传入神经元所在的三叉神经节中是否存在辣根过氧化物酶(HRP)和Glu双标细胞。结果：三叉神经节眼上颌部内可见HRP单标、Glu单标、HRP-Glu双标三种细胞。结论：大鼠牙髓中存在Glu能的神经末梢。
关键词：谷氨酸；牙髓；辣根过氧化物酶；免疫组织化学；大鼠牙痛是口腔科临床上一个十分常见而又原因复杂的问题，其发生机制和传导过程尚有许多不明之处。有学者发现牙髓中含有P物质(substance P,SP)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)等感觉性多肽，因而，认为它们在牙痛信息传递中可能起递质或调质的作用〔1〕。兴奋性氨基酸类物质，如谷氨酸(Glutamate,Glu)，被认为是躯体感觉向脊髓传递过程中起重要作用的神经递质，然而，Glu在牙痛信息传递中是否也有作用还不清楚。为了探明牙痛信息传递机制，首先需要了解牙髓中是否含有Glu能的神经纤维，本研究采用束路追踪和免疫组化相结合的方法，向大鼠磨牙髓腔内注入逆行追踪剂辣根过氧化物酶-麦胚凝集素(HRP-WGA)，在三叉神经节内做HRP呈色和Glu免疫组化反应，观察有无HRP标记的且Glu免疫反应阳性的双重标记细胞，从而证明支配牙髓的神经纤维中是否含有Glu。
1 材料与方法
1.1 动物实验
成年雄性SD大鼠6只，体重200～300 g。在4 g/L戊巴比妥钠(每100 g体重注射1 ml)腹腔注射麻醉下行左上颌第一、二磨牙面开髓，清理髓腔。将50 g/L HRP-WGA (9 g/L无菌生理盐水配制)溶液用微量注射器取2 μl，两个牙髓腔内各注射1 μl，留针5～10 min，然后用磷酸锌水门汀暂时。动物存活2～3 d。
1.2 切片制备
动物在过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸，经升主动脉插管。先用9 g/L生理盐水100 ml冲去血液，再灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)400 ml。注毕立即取双侧三叉神经节及左侧上颌骨(连同左上颌后牙)。三叉神经节置入200 g/L蔗糖溶液内浸泡过夜至组织块沉底(4 ℃)，冰冻连续切片，片厚10 μm，裱于洁净载玻片上。左侧上颌骨经固定脱钙液完全脱钙后，置入200 g/L蔗糖溶液内脱水24 h(4 ℃)，沿牙长轴冰冻连续切片，片厚30 μm，收集于0.01 mol/L KPBS内，以观察HRP-WGA注射点是否准确，有无溢出至根周组织。
1.3 HRP呈色反应
用以钨酸钠作为稳定剂的HRP呈色方法〔3〕，其过程简述如下：①三叉神经节、颌骨(含牙)切片入蒸馏水洗2～3次；②入反应液室温避光温育1 h(100 ml反应液由1 g钨酸钠、pH5.0～5.4的0.2 mol/L PB 50 ml、1 mol/L HCl l.5 ml、TMB溶液1.5 ml和蒸馏水47 ml混合而成)；③反应从加入体积分数(φ)=30%H2O20.7 ml开始，每10 min再加0.7 ml，至反应结束；④结束反应时用0.05 mol/L PB(pH5.0～5.4)洗3～6次，每次2～3 min；⑤加强：将反应后的切片从0.2 mol/L PB中取出放入由20 g/L CoCl22 ml、DAB 30 mg、蒸馏水50 ml、0.2 mol/L PB(pH7.4) 48 ml，φ=0.3% H2O2 30 μl组成的溶液中室温孵育30 min；⑥0.1 mol/L PB(pH7.4)终止反应。右侧三叉神经节切片经加强反应后继续做Glu免疫组化反应。左侧三叉神经节及颌骨(含牙)切片经裱片，晾干、脱水、透明、封片即可直接在显微镜下观察。
1.4 Glu免疫组化反应(ABC法) ①入含φ=0.3% H2O2的甲醇液中，室温15 min；②入含3 ml/L Triton X-100的0.01 mol/L KPBS中，室温30 min；③入兔抗Glu血清(1∶5000，Sigma，用小牛血清稀释液配制)，4 ℃孵育48 h；④入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Vector)，室温孵育2～4 h；⑤入ABC复合物(1∶500,Vector)，室温孵育2～4 h。上述每一步骤后均用0.01 mol/L KPBS洗切片3次，每次10 min。最后用葡萄糖氧化酶法呈色。呈色后的切片经晾干、脱水、透明、封片后在Olympus BH2显微镜下观察。