大鼠牙髓伤害性刺激诱导延髓内Fo表
摘要目的：研究牙髓伤害性信息在延髓传入的相关部位。方法：用抗Fos 蛋白的免疫组织化学方法，对大鼠牙齿机械穿髓后诱导的延髓内Fos表达部位进行了观察。同时结合酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化方法，观察FOS阳性神经元与TH阳性神经元的关系。结果：Fos样免疫反应神经元主要分布在同侧三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc) 、双侧延髓内脏带(孤束核、腹外侧区及二者之间的网状结构)。在抗Fos 和抗酪氨酸羟化酶的双重免疫染色切片上，见到延髓内脏带内许多Fos阳性神经元的胞浆同时呈TH样免疫反应(Fos-TH双重阳性细胞)。结论：
三叉神经脊束核尾侧亚核在牙髓伤害性信息传递过程中具有重要作用；延髓内脏带可能参与了调控牙髓暴露所致的疼痛应激反应。
牙痛是口腔疾病中最常见的临床症状，是一个复杂的病理生理及心理过程。关于牙痛的中枢传导途径及调控机制，目前尚不清楚。有研究认为三叉神经脊束核是牙齿伤害性信息传入延髓的部位［1］。但这不能解释患者在罹患牙痛的同时常常出现的呼吸、心跳、血压、情绪等变化。延髓内脏带是九十年代提出的延髓内与内脏感觉、应激反应、呼吸、心血管调节等有关的一个新的机能结构区，儿茶酚胺能神经元是它的主要功能神经元［2］。近年来研究发现外周伤害性刺激可诱导中枢有关的神经元表达Fos蛋白，Fos是神经元被刺激激活的标志［3］。本研究采用显示Fos的免疫组化方法，对大鼠机械穿髓所致的疼痛诱导的延髓内Fos表达阳性神经元的分布进行了观察，探讨延髓内与牙痛传入相关部位的可能作用。同时结合酪氨酸羟化酶(儿茶酚胺的代表物，TH)免疫组化方法，探讨延髓儿茶酚胺能神经元与Fos表达的关系， 以期为牙痛的中枢机制研究在延髓部位提供较为全面的形态学上的依据。
1 材料和方法
成年SD雄性大鼠10只，体重200～250g。术前将动物置于安静的环境饲养 24h以上。随机分为实验组(n=6)，手术操作对照组(n=2)，正常对照组(n=2)。
1.1 实验组
1.1.1 机械穿髓动物模型的制作［4］
大鼠先用乙醚诱导麻醉，再腹腔注射4g/L戊巴比妥钠(每100g体重1ml)。 动物麻醉平稳后，于右上颌第一磨牙面用高速涡轮机开髓至点状露髓。术毕将动物送回与术前相同的环境存活2h。
1.1.2 切片制备
动物在过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸， 经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲去血液，继之灌注含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L 磷酸缓冲液(PB，pH=7.4)400ml。注毕立即取延髓置于200g/L蔗糖溶液内浸泡过夜(4℃)。冰冻连续切片，片厚30μm，置0.01mol/L PBS内。
1.1.3 Fos免疫组化反应(ABC法)
①切片首先放入含3ml/LH2O2的甲醇液中室温下30min。②置入含3g/L TritonX-100的PBS中，室温30min。③置入兔抗Fos血清(1:3000，Sigma，用小牛血清稀释液稀释)，4℃孵育48h。④置入生物素标记的羊抗兔IgG(1:500，Vector)，室温孵育2～4h。⑤入ABC复合物( 1:500，Vector)，室温孵育2～4h。上述每一步骤后均用0.01mol/L PBS洗切片3次， 每次10min。最后用葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法呈色，室温下反应10～15min。反应后的切片分为两套，一套经裱片、晾干、脱水、透明、封片即可观察。另一套继续进行以下TH免疫组化反应。
1.1.4 TH免疫组化反应(ABC法)
①入小鼠抗TH血清单克隆抗体(Sigma)，4℃孵育48h。②入羊抗鼠IgG(1:500，Vector)，4℃ 24h。③入ABC复合物(1:500，Vector)，4℃ 24h。④DAB呈色。切片经裱片、晾干、脱水、透明、封片，即可观察。
1.2 对照组
1.2.1 手术操作对照组(n=2)：动物经与实验组相同的麻醉过程后，不做机械穿髓，只空开涡轮机，使刺激环境及其余过程与处理组同，以观察非牙髓刺激引起的延髓Fos表达。存活2h后按1.1.2方法处理。
1.2.2 正常对照组(n=2)：正常大鼠按1.1.2方法处死，作Fos免疫组化反应，以观察正常状态下延髓的Fos表达。