微环境对牙髓再生影响的研究进展
年轻恒牙因罹患牙髓坏死或根尖周炎，其牙根的继续发育将受到影响。传统的根尖诱导成形术易导致患牙牙本质壁薄、牙根发育不足并增加远期根折的风险。牙髓再生治疗是一种新的策略，它通过彻底有效的根管消毒，形成适宜干细胞增殖和分化的微环境，利用组织工程三要素，即干细胞、生长因子和支架的作用，促进根管内牙髓牙本质复合体再生，使牙根得以继续发育。
参与牙髓再生的干细胞主要包括牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）。干细胞的命运和生物学行为受到内在因素（转录因子、表观遗传机制）和外在因素（微环境）的共同调节，其中微环境在决定干细胞命运方面起着关键作用。微环境由直接影响细胞或细胞群周围条件的因素构成，这些因素通过与细胞的动态相互作用直接或间接地影响细胞生物学行为。本文就微环境对牙髓再生相关干细胞的影响以及创造适宜牙髓再生微环境的研究现状和展望进行综述。
1.炎症微环境
微生物及其毒性产物在入侵牙髓组织时，成牙本质细胞、内皮细胞等细胞通过模式识别受体（如Toll样受体、NOD样受体）识别并与细菌表面的病原体相关模式分子（如脂多糖）结合，激活NF-κB和p38MAPK信号通路，从而促进炎性介质如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6的产生，这使得牙髓组织或根尖周组织处于炎症微环境之中。大量炎性因子可改变干细胞微环境，影响干细胞的活性和功能，甚至引起细胞凋亡，从而影响干细胞介导的组织再生。
Yang等研究发现，TNF-α和IL-1β可促进DPSCs的增殖能力和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性升高，并诱导矿化相关基因牙本质涎磷蛋白（dentin sialophos-phoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）等的表达，而随着培养时间的增加，DPSCs的增殖能力受到抑制并且ALP活性逐渐下降。
与之相似，TNF-α和IL-1β的短期作用可提高SCAP的增殖和矿化能力，但长期的炎症刺激对干细胞的矿化能力和成牙本质/成骨相关基因的表达有抑制作用，甚至引起细胞凋亡的发生。炎症微环境对干细胞的影响作用与炎症因子的浓度具有密切关系。Qin 等发现，低浓度的TNF-α（1、10 ng/mL）有利于DPSCs表达骨基质蛋白（ALP、骨桥蛋白、骨钙素）并上调成骨转录因子Osterix 和Runx2 的表达水平，而高浓度TNF-α（50、100 ng/mL）可通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制DPSCs表达矿化相关基因。
2.低氧微环境
当炎症或牙外伤造成的牙髓神经血管束损伤，或牙髓血管再生术后新生血管尚未形成，都会造成髓腔内的干细胞处于低氧环境中。因此，研究低氧微环境中干细胞的活性和功能状态，对牙髓再生研究具有更重要的意义。有学者在低氧环境中分离、扩增SCAP，发现低氧可增强SCAP的增殖能力，并维持其经典间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）标志物的表达。
低氧条件可促进缺氧诱导转录因子-1（hypoxia-inducible transcription factor-1，HIF-1）的产生。HIF-1通过激活血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素、胎盘生长因子和血小板衍生生长因子等促血管生成因子基因的转录，在血管生成中发挥重要作用。
有学者报道VEGF在低氧诱导的DPSCs中的表达量约为常氧条件培养的DPSCs表达量的8倍。因此，低氧微环境有助于维持干细胞未分化状态，增强干细胞的可塑性。不同种类的干细胞在低氧环境下的反应也有所不同。Shi等认为低氧环境在提高DPSCs增殖能力的同时，降低了其成牙本质/成骨向分化的潜能。而有研究证明低氧可促进人牙周膜干细胞成骨向分化。
Antebi等研究发现，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）在低氧（1%O2）环境中培养48 h后其增殖能力得到提高，而培养10 d后BMMSCs表面标志物（CD44、CD105）的表达水平和增殖能力降低，但无论是短期培养还是长期培养，低氧环境都可上调VEGF的表达并显著提高BMMSCs的代谢活性，推测低氧微环境对干细胞的影响与干细胞在低氧微环境中的暴露时间相关。
Vanacker等研究显示，低氧不仅会促进SCAP的成骨向分化以及VEGF的分泌，还可上调神经发生相关基因以及神经元标志物的表达，促进SCAP的神经元向分化。低氧条件更接近干细胞的生理微环境状态，因此，探究低氧微环境对干细胞的调控作用，合理调节低氧微环境，有助于促进干细胞的增殖和分化，以及再生组织中新生血管形成和神经分化的发生，进而促进牙髓再生。
3.力学微环境
微环境产生的力学因素包括静态基质硬度、黏弹性等多种物理性质以及流体剪切应力、压缩应力等。机械应力可刺激力学感受器激活细胞内信号通路，能够改变细胞形态、结构，调控细胞功能状态。应力刺激一直存在于牙髓组织生长发育过程中，如在牙齿萌出时牙髓受到拉伸力，长期的咀嚼力与继发性牙本质形成有密切关系，不当的正畸力会造成牙髓变性坏死。
不同种类的细胞对同样的应力刺激反应不同。有学者对DPSCs和SCAP施加不同大小的周期性机械压应力，结果显示两种细胞的增殖能力均受到显著抑制，且DPSCs加力组的ALP活性显著下降，矿化结节的形成明显减少；而SCAP加力组表现出成牙本质/成骨向分化能力增强。应力的加载方式也是影响细胞对应力刺激反应的一个重要因素。
Hata等研究显示，单轴机械牵张可通过激活ERK途径，促进DPSCs增殖，抑制其成骨向分化。有学者通过模拟牙本质小管结构的仿生支架以及一定大小的机械压缩作用对DPSCs进行诱导，检测发现成牙本质细胞特异性标志物DSPP和釉质溶解素的表达增加，并且DPSCs呈成牙本质细胞样改变。此外，基质的力学性能也会显著影响细胞的功能和行为。有研究证明SCAP在硬度较大的水凝胶基质中的增殖能力提高。
He等研究发现，BMMSCs的ALP活性和矿化能力随着基质凝胶硬度的增加而提高。掌握力学微环境对干细胞的调节作用，有助于通过改变微环境的物理化学性质，调节干细胞对力学信号的反应，增强干细胞活性和分化能力，这对促进牙髓再生有着重要意义。
4.仿生微环境
模拟特定干细胞生理微环境的结构和生物学功能为组织工程提供适宜的仿生微环境，有助于调动牙髓再生相关干细胞的增殖、分化潜能，促进具有生理形态和功能的牙髓组织再生。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是存在于细胞之间并参与构成细胞微环境的动态三维结构，可以为细胞提供空间和机械刺激从而引导细胞的行为活动。因此，ECM是牙髓牙本质复合体再生组织工程的理想支架。
通过组织脱细胞制备无细胞的ECM 生物支架，可以在不影响ECM机械性能和生物性能的同时去除细胞和抗原成分，保存其纳米结构环境以及纤维和黏附蛋白形成的网络结构，以调节细胞的行为活动。有学者通过脱细胞技术制备牙髓干细胞衍生细胞外基质（dental pulp stem cell-derived extracellular matrix，DPM），将DPM作为支架与DPSCs放入牙本质片段后移植到裸鼠皮下，2个月后组织学上显示形成与天然牙髓类似的纤维组织以及成牙本质样细胞。
仿生ECM支架含有的细胞外基质是由与生理含量相似的特异性人类蛋白质组成，通过临床转化可有效降低不良免疫反应的发生。有学者利用骨髓间充质干细胞和内皮细胞的细胞外基质制作复合ECM生物支架，证明该ECM生物支架可促进人DPSCs和BMMSCs的成牙本质向分化，而且与牙髓ECM支架相比，复合ECM生物支架促进VEGF等促血管生成基因的表达能力更强，而组织血管化是牙髓功能性再生的重要前提。此外，利用纳米材料制作再生支架，模拟细胞外基质的结构为干细胞的附着、增殖、分化和生物矿化提供良好的微环境，有助于牙髓的功能性再生。
有学者研制出一种纳米纤维明胶/二氧化硅生物活性玻璃（nano-fibrous gelatin/silica bioactive glass，NF-gelatin/SBG）复合支架，其中的纳米纤维明胶可高度模拟体内天然ECM的物理结构和化学组成，热诱导相分离技术可调节支架孔隙大小和结构，从而构建出一个适合牙髓再生的仿生微环境，促进支架中细胞与材料的相互作用，显著促进牙髓干细胞的增殖分化和生物矿化。
在牙髓再生研究中，纳米材料也可与生长因子、药物、干细胞等结合制成功能性纳米支架。将抗生素（环丙沙星和甲硝唑）包埋在释放一氧化氮的仿生纳米基质凝胶中制成一种多功能纳米基质凝胶，不仅可以模拟ECM的结构，还具有控制性携带和释放抗生素、一氧化氮和生长因子的作用。一氧化氮可调节VEGF的水平，促进血管生成，并且具有一定的抗炎作用。
研究表明，此仿生纳米基质凝胶具有促进牙髓牙本质再生以及再生组织血管重建的潜能。功能性纳米支架可通过材料中的生长因子、药物等物质的可控释放，形成一个利于牙髓再生的微环境，更精确地调节再生过程。
5.结语
组织再生成功与否与干细胞的状态和功能息息相关。炎症微环境、低氧微环境、力学微环境等不同微环境状态都会影响干细胞的增殖、分化等功能。对微环境进行合理调控，利用新型材料和技术尽可能模拟干细胞微环境，有助于调节干细胞的活性和生物学行为，从而更好地促进牙髓牙本质复合体再生。
