水凝胶在口腔组织工程中的应用与进展
1.口腔组织工程中水凝胶生物材料的制造
水凝胶除了具有良好的生物相容性和可调节的物理性能之外，良好的可塑性使其在生物医学领域的应用具有极大优势。人体天然解剖结构多变且复杂，运用各种生物制造的手段对水凝胶进行仿生结构的制造，是近年来的研究热点。
1.1 孔隙或通道成形
为了给细胞生长、吸收营养物质、进行代谢活动提供空间，使用各种技术制造孔隙或通道是非常重要的。传统的孔隙或通道成形技术包括发泡、颗粒浸出、孔重整剂方法和泡沫浸渍，其存在孔径大、孔道不贯通、力学性能差等缺点，以及可能含有化学试剂残留物，会损伤机体细胞。目前，3D打印和微流控技术常被用于制造孔隙或通道。通过调整挤出材料的空间，实现对孔隙或通道结构的控制，可高精度地制造弯曲或静脉状通道。微流控系统形成的结构可用来包裹细胞，实现低材料消耗和高精度。
1.2 聚合
聚合是指2个或2个以上分子结合形成含有重复结构单元的高分子量化合物的化学反应，这是合成高分子生物材料的主要过程。传统的聚合工艺可分为缩聚、开环聚合（ring-opening metathesis polymerization，ROP）和直接聚合。现今，官能团或多肽被用于聚合，形成具有特定功能的新材料，这些改性材料可与组织工程等技术相结合。
Onofrillo等将甲基丙烯酸酐化明胶（gelatin methacrylate，GelMA）与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光团共价结合，制备了荧光标记敏感水凝胶，可用于跟踪新生软骨期间生物支架的降解情况。
1.3 微针
微针是一种微小的针状结构，可穿透表皮角质层或黏膜进行给药，其长度为25 ~ 2000 μm。微针具有无痛、无创及可控的优点，是十分具有前景的促进创口愈合和组织再生的方法。目前，用于制备微针的技术包括微模塑、图案法、光刻和蚀刻、3D打印。由于微模塑的操作简单、廉价和可重复性，已在医学领域广泛使用。抗菌、抗炎、抗癌、组织再生刺激和表面麻醉是载药微针的五大主要应用方向。目前研究中使用微针装载的内容物包括抗生素、激素、光敏剂、细胞因子和麻醉剂。
Song 等利用微针作为甲硝唑（metronidazole，Met）的载体治疗牙周病变。Guo等制备了含有倍他米松21-磷酸钠（betamethasone disodium phosphate，BSP）和倍他米松17，21-二丙酸（beta-methasone-17，21-dipropionate，BDP）的透明质酸（hyaluronic acid，HA）微针贴剂，可更好地治疗口腔溃疡。
Manimaran等研究表明，负载吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）的微针贴片对口腔癌光热治疗有积极作用。Zhang等使用GelMA微针持续释放细胞因子，促进牙周炎患者组织愈合和再生。Lee等发现负载利多卡因的溶解微针可作为一种安全无痛的口腔科手术局部麻醉方法。
1.4 静电纺丝
静电纺丝是一种在强电场中喷射聚合物溶液来生产纳米纤维的制造技术，其可作为制备具有多孔微结构的可生物降解膜和支架的有效方法。这种结构可被功能化以携带无机物、生物活性分子或药物，并具有模仿天然细胞外基质的潜力。这种技术所制成的生物膜，可用于牙周组织再生。静电纺丝的主要缺点是效率较低、污染大。
Mahmoud等利用静电纺丝技术制备了纳米级β-三磷酸钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）负载的GelMA/聚己内酯-三磷酸钙（polycaprolactonetricalcium phosphate，PCL-TCP）光交联复合纤维膜，其显著增强了骨再生能力。Ji等开发了核-壳型聚乳酸-羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）/明胶纳米纤维，该纤维可顺序释放P物质（substance P，SP）和阿仑膦酸钠（alendronate so⁃dium，ALN），从而促进种植体即刻骨整合。
1.5 微流控
微流控技术能精确控制微量液体，制备微小结构，如核壳结构的液体用于颌骨缺损修复。将2种不混相流体以一定的流速从微通道的不同端口进入并相遇，通过施加电压、气压、磁场等外力，或调节微通道结构和流体流速，诱导微液滴的形成。通过构建或堆叠液滴和纤维，可实现具有不同结构和材料成分的多种三维结构。通过将细胞包裹或装入液滴中能制造含细胞的结构。微流控技术具有规模小、材料消耗少、灵敏度高、精度高等传统制造技术无法比拟的优势。
Zhang等根据微流控原理制备了可注射的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-海藻酸盐/合成锂皂石（RGD-Alg/Lap）复合水凝胶微球，将人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）和血管内皮生长因子共包封，该微球具有促进髓样组织再生和新微血管形成的优异能力。Liang等成功制备了基于微流控技术的核壳微胶囊，将hDPSCs与人脐静脉内皮细胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）共包埋，有望实现血管化牙髓再生。
Zheng等在含有脱细胞牙髓基质衍生生物活性因子的水凝胶微球上培养hDPSCs，hDPSCs微载体在体内实现了牙髓-牙本质复合体的再生。
1.6 3D打印
3D打印是近年来在医药领域应用广泛的增材制造技术，既往多用于制造金属、生物陶瓷、聚合物和复合材料。其中，DLP技术常用来进行水凝胶的制造，能够制造出立体并带有中空结构的三维模型。DLP是一种利用材料的光固化特性进行逐层印刷的制造技术，是高速制造高精度的打印方法之一。DLP打印的主要挑战来源于对生物墨水的可打印性、生物相容性和机械性能的高要求。
DLP的研究经历了从单材料打印到多材料打印，从无细胞打印到生物打印的发展历程。Sun等提出了一种数字光处理生物打印（digital light biology processing，DLBP）方法，该打印技术适用于精细结构的制造，从而实现生物材料的功能化，分支血管、皮肤、耳等结构都可用这种方法打印出来。Zhou等研究提出了一种利用DLP技术打印功能性活皮肤（functional living skin，FLS）的创新方法，其具有相互连接的微通道，可有效形成新生血管并促进皮肤再生。Xie等使用DLP系统打印的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）负载水凝胶微球（microgels，MSs），在4周内实现了骨快速修复。
2.水凝胶生物材料在口腔组织工程中的应用
口腔颌面部包含硬组织、软组织、血管和神经等多种组织类型，需要不同的组织工程方法修复。在硬组织方面，如何找到与复杂组织机械强度匹配的材料仍是一个很大的挑战。软组织异常通常使用邻近皮瓣修复，但这种方法存在术后粘连和收缩等问题。血管和神经系统的损伤可引起组织挛缩、坏死、坏疽、麻木和运动障碍等。因此，需要探索适合口腔组织工程复杂情况的理想水凝胶生物材料。
2.1 骨组织再生
2.1.1 根尖周骨缺损
根尖周病变是引起口腔颌面部骨缺损的常见原因。根尖周炎常影响根尖周围的牙槽骨和根尖牙骨质，而根尖周囊肿通常在死髓牙的根尖部形成，造成牙槽骨缺损。目前，根尖周骨缺损的治疗方法主要是材料填充或注射。早期应用于根尖周骨缺损治疗的商业化产品主要是无机材料，如Bio-Oss®、Lando®、Gegreen®等。随后出现了Bio-Oss胶原蛋白®和Heal-all®等复合材料。
Li等研究了壳聚糖包被的氢氧化钙（CS-EC@Ca）微胶囊的抗炎和成骨特性，在兔下颌缺损模型中，CS-EC@Ca微胶囊可显著减少炎症，促进炎症环境下的成骨。
2.1.2 牙槽骨量不足
牙槽骨增量术通常用于解决牙槽骨体积不足的问题，为后续治疗（如口腔种植术）做准备。引导骨再生术（guided bone regeneration，GBR）是一种结合生物膜和骨移植的技术，使用骨粉填充缺损，并在表面覆盖生物膜；该技术常见于前牙种植手术。Dongqi等利用4D打印技术制备了由形状记忆聚合物（shape memory polymer，SMP）层和水凝胶层组成的多反应性双层变形膜，该膜具有动态调整其三维几何形状以匹配临床特定骨形状的能力。Ghavimi等研发了一种应用于GBR的生物膜，用于姜黄素和阿司匹林的缓释和局部递送，在犬颌骨缺损模型中，该膜表现出优异的抗菌活性和骨再生效果。
2.1.3 颌骨囊肿和肿瘤所致骨缺损
由于颌骨特殊的解剖结构和复杂的胚胎发育过程，其是人类骨骼中最易发生囊肿的部位。与根尖周骨缺损不同，颌骨囊肿引起的缺损需要具有更好的机械强度、个性化的轮廓支撑效果。Gupta等通过结合3D打印和冷冻干燥技术制造了个性化可吸收PCL支架，由凝胶、羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）和HA复合物制成的水凝胶涂层被应用于支架上，其强度显著高于天然水凝胶。
Ye等通过挤出式3D打印技术，基于聚离子复合物（polyion compound material，PIC）支架、梯度水凝胶和种子细胞，制备了用于修复下颌骨缺损的分层血管化工程骨（human vascularized engineered bone，HVEB），这种修复技术在模拟膜内骨化的时空结构的同时，在血管化和骨再生方面表现出高效率。颌骨肿瘤包括良性和恶性肿瘤，主要发生在上颌骨、下颌骨和周围组织。由于肿瘤侵袭范围广，且颌骨周围解剖关系复杂，因而肿瘤导致的颌骨缺损修复难度较大。Suo等利用3D打印技术成功制备了氧化石墨烯/HA/壳聚糖复合水凝胶支架，具有兼具强度支持和骨引导生成能力的特点，有望应用于口腔颌面部肿瘤等造成的骨缺损修复。
2.1.4 外伤所致颌骨缺损
火器伤在战争时期多见，在现代由于汽车和运输工业的迅速发展，交通事故是导致颌面外伤的主要原因。与长骨相比，外伤所致的颌骨缺损由于血液循环丰富、结构复杂，更易发生感染。因此，迫切需要开发具有良好修复重建功能和有效抗菌性能的生物材料来治疗外伤性颌骨缺损。Nie等通过3D打印技术研发了具有优异光热抗菌和成骨能力的个性化GelMA/β-TCP/海藻酸钠（Sr2+）/MXene（Ti3C2）支架，其中MXene是一种新型的二维材料，由金属碳化物或氮化物组成；该支架能够协同抗菌和成骨作用，加速感染组织愈合和骨再生。
2.1.5 髁突软骨缺损
髁突参与咀嚼和言语等生理功能，因此需要高性能的修复材料。髁突修复方法的研究已从形态修复发展到兼顾功能重建。修复范围也逐渐从小范围缺损修复发展到全颞下颌关节重建。Wang等使用硫代HA/Ⅰ型胶原混合水凝胶、双磷酸盐、兔BMSCs和软骨细胞制备了双层复合支架，该支架可模拟髁突软骨缺损的结构，实现髁突软骨再生。
2.2 软组织再生
2.2.1 口腔黏膜
溃疡是口腔黏膜常见病变。由于溃疡的机制尚不清楚，临床常仅对症治疗。主要方法是局部用药，可细分为局部注射和经黏膜给药。经黏膜给药的形式包括凝胶、软膏、漱口水和贴剂。然而，口腔黏膜上皮的屏障作用和唾液的稀释作用会对给药效率产生负面影响。目前，微针已成为溃疡治疗药物稳定释放的研究热点。Guo等制备了一种可溶解的微针贴片，该贴片载BSP-BDP和HA，可显著促进口腔溃疡的愈合。Wang等构建了含有醋酸地塞米松、维生素C和盐酸丁卡因的多药微针贴片，该贴片不仅增强了地塞米松的抗炎作用，还具有维生素C的促大鼠主动脉内皮细胞增殖作用。
Li等研究制作了一种由HA 尖端部分和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）基底部分组成的双层微针贴剂，进一步促进药物释放效果。由创伤、炎症等因素引起的黏膜病变需切除时，会产生黏膜缺损。传统的黏膜缺损修复利用自体皮瓣或商业产品，包括Mucograft®（猪胶原蛋白）、Bonanga®（牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白）和Matriderm®。Zhu等使用凝胶、纳米黏土和单宁酸开发了具有优越物理化学性能的低膨胀黏性水凝胶（GNT），结果表明GNT具有较强的止血性能和优异的抗菌抗炎作用，可加速缺损黏膜的修复。
Mardani等制备了脂肪组织源性干细胞/姜黄素/胶原支架，用于治疗大鼠口腔黏膜缺损。Zhou等使用脱细胞血管基质/0.25%Ⅰ型类人胶原蛋白支架与人牙龈成纤维细胞、人牙龈上皮细胞和血管内皮样细胞构建血管化口腔黏膜样结构，其能促进口腔黏膜修复。
2.2.2 皮肤
皮肤由表皮和真皮层组成，包括毛发、皮脂腺和汗腺等附属物。由于自体组织的局限性、皮肤供体的稀缺及皮肤移植区域的损伤，皮肤缺损的高质量和快速修复仍难以实现。早期用于皮肤缺损治疗的商业产品主要是脱细胞人工皮肤，常通过化学合成或脱细胞制备，如Alloderm®（人异体脱细胞真皮基质）、Biobrane®（猪Ⅰ型胶原蛋白）、Integra®（聚硅氧烷、胶质硫酸、6-硫酸软骨素）。
随后研发出含有活细胞的产品，如TransCyte®（成纤维细胞）、Apligraft®（成纤维细胞、角质形成细胞）和EpicelTM（表皮角质形成细胞）。目前研究皮肤缺损修复的策略大致可分为无细胞植入和细胞负载植入，此外研究人员正在寻找新技术用于制备促进血管化的皮肤替代品，以获得更好的临床效果。Zhang等制备了聚多巴胺/葛根素（PDA/PUE）纳米颗粒掺入聚乙二醇二丙烯酸酯杂化水凝胶（PEG-DA/PDA/PUE），作为创口愈合材料修复大鼠皮肤缺损。Wu等将电纺丝姜黄素与壳聚糖/聚乙烯醇/呋喃/聚己内酯纳米纤维结合，用间充质干细胞接种支架来提高皮肤创口愈合效率。
2.3 神经组织再生和血管化
2.3.1 神经组织再生
神经是调节机体生理活动的组织，支配着器官的感觉和运动功能。神经组织再生关系着组织的功能恢复，在口腔颌面部重要的神经是面神经和牙髓神经。面神经的再生大致可分为自体神经移植和神经导管移植两大类。这些手术存在神经扭转、供区组织损伤、材料性能不佳等问题。近年来，研究人员将人工神经导管与神经营养因子、导电材料或细胞结合，以更大程度地实现神经功能恢复。Zhang等分析了胶原/β-TCP导管对面神经间隙的桥接效果，认为这些导管为神经再生提供了一个有益的管状微环境。
Ma等研发了大鼠尾源性胶原蛋白导管，将胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）固定在导管中，以实现GDNF的可控释放；该导管可显著促进神经再生，并最终被自体降解。Mu等创造了一种三维分层排列的纤维蛋白纳米纤维水凝胶（fibrin nanofiber hydrogels，AFG），类似于神经细胞外基质，修复了兔面神经损伤。
既往的牙髓再生主要是通过置入负载诱导因子的无细胞支架来诱导干细胞迁移。目前，研究人员正在探索将细胞三维培养等技术与新型材料结合起来进行牙髓再生的方法。Ruangsawasdi等使用含有干细胞因子（stem cell factor，SCF）的纤维蛋白凝胶支架促进细胞归巢和功能牙髓再生。Wang等制备了一种装载外泌体的热敏水凝胶，研究表明，负载外泌体的水凝胶具有促进新牙髓样组织形成的能力。
Zhu等将携带猪牙髓干细胞（swine dental pulp stem cells，sDPSCs）的水凝胶植入小猪牙根管内进行牙髓再生，可观察到牙髓样组织的生成，并沿管壁形成一层新沉积的牙本质样组织。Qian等成功地利用DLP制造了负载hDPSC的GelMA微球，并证明了该微球在牙髓再生中具有良好的应用前景。
2.3.2 血管化
植入物较小时，细胞能通过渗透扩散进行物质代谢；但在较大的移植物中，没有血管作为营养的通道，内部无法进行代谢，继而坏死。移植物血管化研究从结构模拟、生物活性分子的应用逐渐发展到血管的全面重建。Zheng等利用3D打印技术制作了一种基于水凝胶的微血管结构，该结构具有分层和分支通道，其精度为30 μm，大致相当于天然毛细血管的尺寸。Shao等利用同轴生物打印技术制备了形态可控的凝胶微纤维，这些微纤维被用来制造含有HUVECs的血管样管腔组织。
Kuss等将人脂肪来源的间充质干细胞和HUVECs包裹在3D打印的PCL/羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）生物活性水凝胶复合支架中，其能促进微血管和血管的形成和吻合。Ye等提出了一种由成血管和成骨模块组成的分层血管化工程骨，其中的sonic hedgehog（Shh）信号通路被激活，内皮细胞成功长入成骨模块，形成毛细血管网络。Sun等利用DLBP技术成功地开发了人工分支血管结构，分支血管具有优异的精度、力学性能和生物相容性，HUVECs可完美附着在该结构上并增殖。
3. 结语
水凝胶是一种十分具有应用前景的生物材料。尽管近年来该领域取得了一些进展，但未来的研究仍面临许多挑战。例如：①水凝胶正从同质材料演变为多种复合材料，从无机材料演变为有机材料，最后演变为生物活性材料。但多材料的结合不是单一的加法，其复杂性给研究人员和制造商带来了更大的挑战。②制造技术也从单一技术发展到生物制造的概念。通过多种技术融合所生产的水凝胶，其结构变得越来越精细，同时其产物也越来越具有功能化的效应。③个性化产品常依赖于特定实验室的技术，因此无法大规模生产用于广泛的临床和实验应用。
综上，制造出具有优异理化性质和生物功能的水凝胶以满足临床需求是研究人员的最终目标。未来水凝胶的应用与研究可能从以下方面进一步发展：①随着材料学的发展，研发出更多种类的水凝胶产品以应对不同的场景需求。②越来越多的研究提供了有效的参考依据，使研究人员可根据各种组织的类型、结构和功能选用水凝胶，确定最有效的组织工程技术。③多学科的合作是产生可应用于临床的口腔组织工程水凝胶的关键。
