氯己定在口腔细菌中敏感性下降及其相关机制的研究进展
氯己定(chlorhexidine，CHX)是一种双胍类阳离子消毒剂，可作用于一系列的革兰阳性及阴性菌、部分包膜病毒及真菌。其主要作用机制是通过减弱细胞膜的流动性或破坏其完整性，从而导致细胞膜渗透性增高，细胞内容物泄漏甚至导致细胞死亡。CHX难溶于水但可与酸发生反应形成多种盐类，我国口腔临床常用的复方氯己定含漱液为0.12%浓度的葡萄糖氯己定溶液。
CHX良好的抗菌效果，并能够长时间停留在口腔黏膜及牙齿表面，具有长效性且刺激及过敏反应较小，使其成为口腔领域消毒的金标准，同时也是口腔领域应用最为广泛、频繁的消毒剂。对于由于生理/心理因素或口腔术后无法进行机械性口腔保健措施的患者，CHX 漱口可作为替代性口腔保健措施，用以预防龋病、牙龈炎及牙周炎。
CHX 还被用于重症监护室患者的口腔护理以降低呼吸机相关肺炎的风险。除此，CHX含漱液常规用于牙周及种植手术术前患者漱口，用以减少患者口腔细菌并防止气雾污染。在牙髓治疗中，CHX溶液也被作为根管冲洗剂应用。除溶液外，含有CHX 的其他剂型包括凝胶、薄片及牙刷涂层等也被用于控制口腔菌斑。
CHX 广泛无限制的应用可诱发多种菌株敏感性下降。屎肠球菌(Enterococcusfaecium )、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)以及肠杆菌属(Enterobacterspp.)被统称为ESKAPE病原体，是最重要的院内感染病原体。目前研究已在ESKAPE病原体中证实，相比于CHX进入临床应用前分离的菌株，近期分离的临床菌株CHX 敏感性显著下降。
CHX 还可诱导ESKAPE病原体产生最后一线抗生素的交叉耐药性。除此，ESKAPE病原体感染患者中，CHX 敏感性降低菌株来源的患者病死率相对于CHX 敏感患者更高。因此，CHX敏感性不仅能够衡量其消毒效果，还可能成为潜在抗生素耐药性及感染风险的间接评估指标。
人类口腔中有超过700种细菌定居，口腔细菌不仅能够引发多种口腔疾病，并能通过进入系统性血液循环或直接播散至机体远处器官对多种重要的全身性疾病产生影响。口腔细菌频繁暴露在CHX下，若其获得对CHX的耐药基因或抗生素交叉耐药基因，存在向机体其他部位菌群扩散的风险。然而，相比于CHX 在口腔领域的使用程度以及口腔细菌与机体关联的密切程度，目前对于口腔细菌的关注极度匮乏。因此，本文旨在回顾CHX在口腔细菌中敏感性下降的证据，并对其耐药机制进行综述，以对CHX在口腔临床的应用提出警示。
1. 口腔细菌CHX 敏感性下降的相关证据
目前国内外对于CHX耐药性(又被称作抗性)的定义尚未明确。抗生素耐药性可通过最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，MIC)进行评估，若菌株MIC值高于美国临床和实验室标准协会(clinicaland laboratory standardsinstitute，CLSI)或欧盟药敏试验标准委员会(Europeancommitteeon antimicrobial susceptibility testing，EUCAST)制定的MIC 临界值即可被定义为耐药菌株。然而，由于相关协会尚未制定明确的CHXMIC耐药性临界值，目前仅能通过CHX MIC值的上升或下降对其敏感性进行衡量。
因此，本文将用敏感性下降对菌株出现CHX MIC值升高的表型进行描述，对其基因型的相关机制将使用耐药性进行阐述。上世纪70年代，已有研究发现长期应用含有CHX成分的牙膏(0.5%~1%)或漱口液(0.2%)后，分离自龈上及龈下菌斑的多种菌株如血链球菌、缓症链球菌以及二氧化碳噬纤维菌等发生CHX 敏感性下降。
然而由于其MIC值未出现倍数性上升，因此口腔细菌对CHX 的耐药风险并未得到关注。然而，近期研究发现ESKAPE 病原体出现CHX临床耐药性，并在CHX诱导下产生最后一线抗生素的交叉耐药。因此，口腔细菌对CHX的敏感性也再次受到国内外学者关注。近期研究证实多种重要的口腔致病菌如牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌以及远缘链球菌等长期暴露于亚抑制浓度CHX后，其MIC值可发生多倍上升。牙龈卟啉单胞菌标准菌株和临床分离菌株在CHX 亚抑制浓度连续诱导下(约20代)，其MIC值升高2~4倍。
除此，口腔菌斑分离的链球菌属包括缓症链球菌及变形链球菌等菌株可在CHX 亚抑制浓度诱导下(1~10代)MIC值出现高达8倍的增长。且发生CHX敏感性下降的变形链球菌菌株，同时出现对达托霉素以及克林霉素MIC值升高。根尖周病致病菌粪肠球菌菌株在亚抑制浓度CHX 诱导下，MIC值随着诱导次数(1~10代)持续上升。
与此类似，Verspecht等检测了6株口腔标准菌株包括中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变形链球菌、远缘链球菌以及伴放线放线杆菌是否在亚抑制浓度CHX 诱导下(10代)发生敏感性下降。结果显示中间普氏菌菌株CHX MIC值增加了4倍，其他所有菌株MIC值增长了1.3倍。同时，除具核梭杆菌外所有菌株均出现对阿奇霉素敏感性下降，远缘链球菌菌株四环素MIC值也显著升高。
以上研究提示了口腔重要致病菌长期暴露于低浓度CHX环境下存在敏感性下降及发生抗生素交叉耐药的风险。尽管目前报道的口腔菌株CHXMIC值(一般低于10μg/mL)远低于实际应用浓度，但需要注意的是患者实际应用CHX 漱口后，在唾液稀释下其浓度也大幅度下降。最新研究证明在应用10mL 的0.12% CHX(1200μg/mL)漱口液漱口约4 h 后，唾液中的CHX 浓度下降至10μg/mL以下，并可在唾液中停留12h。因此，应避免口腔细菌非必要长期暴露于低浓度CHX，并应对其敏感性进行定期监控。
2. CHX 耐药机制
主动外排蛋白或主动外排泵(effluxpump)是CHX耐药性的主要调控机制，广泛存在于G+ 菌、G- 菌及真核生物。主动外排蛋白是一种膜转运蛋白，其转运底物包括多种有害物质如抗生素、消毒剂、染色剂及重金属等。因而，其过度表达使得抗生素或消毒剂无法在细胞内积累从而导致敏感性下降，甚至耐药性的发生。除此，CHX 等消毒剂的耐药性还与细菌细胞膜的改变相关。
2.1 主动外排系统的过度表达
目前，与耐药机制相关的主动外排系统可被分为以下6个主要家族:ATP结合转运蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC superfamily)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS superfamily)、耐药结节化细胞分化超家族(resistance-nodulation-celldivision，RNDsuperfamily)、多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion，MATEfamily)、小多重耐药性家族(smallmultidrugresistance，SMRfamily)以及变形菌抗菌物外排家族(proteobacterial antimicrobial compoundef flux，PACEfamily)。
CHX 可激活多种主动外排蛋白及其相关基因的表达，但一些外排蛋白仅转运抗生素，而与CHX 的转运及耐药无关。本文仅对与CHX 耐药机制相关的主动外排系统作一综述。
ABC主动外排系统广泛存在于所有生物，可转运包括代谢产物、维生素、铁及抗生素等多种物质，并与癌症中的耐药性密切相关。已有研究发现，肠球菌临床分离菌株(n=54)及粪便分离菌株(n=50)中ABC 型主动外排基因efrA/B 的表达与CHX及庆大霉素的耐药性密切相关。
蛋白组学分析发现，在亚抑制浓度CHX 诱导下敏感性下降的伴放线放线杆菌菌株中ABC型主动外排蛋白的表达明显上调。上述研究结果表明，CHX 可作为ABC型主动外排蛋白的转运底物，因而其过度表达可将进入细胞内的CHX 过度排出至细胞外，使得CHX无法在细胞内积累，从而发生敏感性降低。MFS主动外排系统是最大且包含最多样转运蛋白的转运体家族。
其转运底物包括多种分子，MFS家族主动外排系统不仅与抗生素耐药密切相关，并且是CHX等消毒剂耐药机制的关键调控者。一方面，CHX敏感性下降与多种MFS型主动外排基因的携带存在显著相关性。例如，在肠球菌临床及粪便分离菌株中，CHX 敏感性下降与MFS型主动外排基因emeA 的表达显著相关。而在金黄色葡萄球菌临床菌株中，CHX 敏感性下降主要与MFS型主动外排基因qacA/B 的携带相关。
另一方面，CHX敏感性下降与一些MFS型主动外排基因的变异有关。CHX 敏感性下降的耐甲氧西林及非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床菌株中均出现MFS型主动外排基因norA 及norB 变异。肺炎克雷伯菌临床分离菌株在CHX 诱导下可发生CHX敏感性下降以及对最后一线抗生素——黏菌素的交叉耐药。
同时这些菌株还出现smvR 基因的变异。smvR 是MFS型主动外排基因smvA 的抑制基因，smvA 的表达上调导致了CHX敏感性下降。除肺炎克雷伯菌外，smvA 对CHX等消毒剂耐药的调控作用在肠杆菌科临床分离菌株中也得到证实。除此，在鲍曼不动杆菌临床分离菌株中CHX可激活MFS型主动外排蛋白amvA 相关基因的表达。
amvA 基因灭活的鲍曼不动杆菌临床分离菌株同时表现出对CHX 及抗生素的敏感性增强(碳青霉烯类、头孢菌素类、氨基糖苷及氟喹诺酮类)。2022年，Royer等通过全基因组关联研究发现大肠埃希菌临床分离菌株中，CHX敏感性的下降与MFS主动外排基因tetA 的表达存在相关性。并且，获得tetA 基因的大肠埃希菌菌株同时发生CHX 及四环素的耐药。
除ESKAPE 病原体，MFS主动外排系统在口腔细菌中也发挥重要作用。粪肠球菌在CHX 亚抑制浓度连续诱导下，可激活一种分子量约为19kDa的新型蛋白表达，并随诱导次数的增多其表达不断升高，这一蛋白为MFS型主动外排蛋白。SMR主动外排系统可转运一系列亲脂性物质包括常见的季铵盐消毒剂如苯扎氯铵及西吡氯铵等。SMR基因也与多种重要病原体中CHX 耐药性密切相关。
携带SMR基因的金黄色葡萄球菌临床分离菌株，相比于未携带SMR 基因的菌株，CHX MIC值相对较高。国内外研究均证实肺炎克雷伯菌临床菌株的CHX 敏感性下降与cepA及SMR 型主动外排基因qacΔE 的携带显著相关。对这些主动外排蛋白进行抑制可导致CHX MIC值降低。SMR家族另一成员KpnEF主动外排蛋白也可介导肺炎克雷伯菌菌株中抗生素及CHX的耐药性。删除这一基因的变异菌株表现出对一系列抗生素(头孢吡肟、头孢曲松、黏菌素、红霉素、利福平、四环素及链霉素)及CHX 的敏感性增强。RND主动外排系统是G- 菌中抗生素耐药机制的重要调控者，然而其在CHX 耐药机制中的作用少有发现。
在鲍曼不动杆菌临床分离菌株中，CHX能够促进RND型主动外排蛋白AdeAB的表达。adeB 的表达上调与CHX 敏感性下降及一系列抗生素的耐药性密切相关。与此类似，在铜绿假单胞菌中CHX 能够激活RND 型外排蛋白mexCD-oprJ 的表达。mexCD-oprJ 基因删除的菌株对CHX 敏感性显著增强。此外，牙龈卟啉单胞菌菌株在CHX连续诱导下，RND 型外排蛋白的表达也显著升高，并同时对CHX 敏感性下降。
这一结果表明，在牙龈卟啉单胞菌中，CHX 可能为RND型外排蛋白的转运底物，RND 型外排蛋白可通过将CHX转运至细胞外从而阻碍其在细胞内积累，进而引发其敏感性下降甚至耐药性的发生。PACE是最近十年内发现的新转运体家族，其转运底物主要为CHX等消毒剂。PACE主动外排系统能够介导G- 菌中多种消毒剂耐药性的发生。
Hassan等于2013年通过对鲍曼不动杆菌进行转录组分析首次发现了PACE 家族的第一个成员，主动外排蛋白AceI。AceI是鲍曼不动杆菌中CHX耐药机制的主要调控者。鲍曼不动杆菌标准菌株在亚抑制浓度CHX 的诱导下，AceI外排蛋白的表达显著升高。将此主动外排基因在大肠埃希菌中进行克隆，大肠埃希菌也获得CHX 耐药性。同时，敲除鲍曼不动杆菌标准菌株中的这一基因可以增强菌株对CHX敏感性。
2.2 细胞膜相关改变
通过对多种菌株进行基因组及转录组分析发现，CHX敏感性下降的菌株除出现主动外排蛋白或相关基因表达升高外，还出现细胞膜特性的改变。在CHX 诱导下发生敏感性下降的粪肠球菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌及具核梭杆菌菌株与野生菌株相比，其细胞表面疏水性显著升高。
这一改变可导致细胞膜渗透性下降，进而阻碍CHX 分子进入细胞从而导致其敏感性下降。同时，CHX敏感性下降的牙龈卟啉单胞菌菌株还发生细胞膜通道蛋白表达的改变。另外一项研究也表明，变形链球菌对CHX敏感性下降除与细胞膜疏水性升高外，还与一种调控细胞膜表面特性基因dlt 的表达相关。
在CHX反复诱导下，敏感性下降的变形链球菌株中dlt 基因的表达显著升高，并在敲除dlt 基因后CHX MIC值明显降低。dlt 基因能够调控脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)的D-丙氨酰化，这一过程可通过改变细胞膜表面的电荷负载影响如CHX等阳离子抗菌物质的耐药性。以上研究表明，CHX 诱导可通过改变细胞膜特性进而阻碍CHX分子进入细胞，从而导致敏感性下降，但这一机制与主动外排系统的相互作用关系尚不明确，有待进一步研究。
3. 结论
目前研究提示了口腔细菌长期暴露于低浓度CHX可出现CHX 敏感性下降及抗生素交叉耐药的风险。未来CHX在口腔领域的应用还将会持续扩大范围，应尽力避免过度及错误滥用而导致口腔临床菌株广泛暴露于亚抑制浓度的CHX。近期这一主题已引发国外学者关注，然而基于我国临床菌株的研究尚处于空白阶段。
由于CHX 在不同地区的使用及管理存在差异，因此基于我国临床菌株的CHX敏感性及其耐药机制亟待进一步研究。可通过定期收集口腔细菌临床分离菌株，并对其CHXMIC值进行定期检测，对收集自不同时间菌株的MIC值进行对比来监控口腔细菌CHX敏感性。主动外排基因如smr、cepA 及qacA/B 等已在多种院内感染病原体中被证实与CHX 敏感性下降相关，然而口腔菌群中上述基因的携带情况尚未明确。未来可对口腔细菌的CHX耐药基因携带情况进行检测，并进一步揭示CHX 敏感性降低的口腔细菌临床分离菌株中主动外排系统的表达情况及细胞膜特性。
