中间普里沃菌在成人牙周炎患者龈下菌斑中的分布
【摘 要】 目的 研究中间普里沃菌在牙周炎病人病变部位和健康部位龈下菌斑中的分布。方法 选择64例成年人牙周炎患者，分别取病变部位和健康部位龈下菌斑，经厌氧培养，挑取产黑色素菌落，经多聚酶链反应鉴定中间普里沃菌。结果 共对614株产黑色素G-厌氧杆菌进行多聚酶链反应鉴定，有112株被鉴定为中间普里沃菌；在病变部位和健康部位，中间普里沃菌的检出率分别是28.1％和12.5％，有统计学差异（P<0.05）；在病变部位和健康部位，中间普里沃菌的检出株数分别是79和33，占产黑色素G-厌氧杆菌分离数的21％和13.9％，有统计学差异（P<0.05）。结论 中间普里沃菌是可疑的牙周致病菌。
【关键词】 牙周炎；中间普里沃菌；16S rRNA本文利用一对根据P.i 16S rRNA设计的引物〔2〕，采用多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)检测AP患者病变部位及健康部位的P.i检出率和数量，了解P.i与AP的关系。
材料与方法
1. 菌株：包括8个标准株：P.i ATCC 25611，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P.g)ATCC 33277,p.g W83,P.n ATCC37665, 产黑色素普里沃菌(Prevotella melaninoginicus, P．m)ATCC25645，不解糖卟啉单胞菌（Porphyromonas assacharide, P.a) ATCC 25260, 人体普里沃菌（Prevotella corporis, P.c)ATCC 33547, 栖牙普里沃菌（Prevotella denticola,P.d) ATCC 33185. 均由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。
2. 引物合成：根据Riggio等报道的P.i 16S rRNA引物序列〔2〕，由美国GIBCO-BRL公司合成引物1（P1）和引物2（P2），P1-5’ CCT AAT ACC AGA TGT TGT CCA CA3’T和P2-5’ AAG GAG TCA ACA TCT CTG TAT CC3’，扩增片段为855bp。
3. 试剂：Taq DNA聚合酶，10×Butfer缓冲液，dNTP，1kb DNA ladder 由美国GIBCO-BRL公司提供。
4. 病例选择：共选择64例AP患者，年龄21～72y，全身无系统性疾病，3月内无抗生素治疗史。每一患者至少有两个牙有牙周袋深≥4mm,探诊明显出血。每一患者选择两颗牙，以牙周袋≤2mm，探诊无出血，龈炎指数≤1为健康部位。
5. 标本的采集、处理及培养：每一取样部位插入两根无菌纸尖至袋底或龈沟底，停留15秒，放入装有1ml预还原转送液的离心管。振荡，稀释，接种于牛心脑浸液平皿，在37℃厌氧环境（含CO2、H2、N2的体积分数分别为10％、10％、80％）培养5～7天。挑取黑色菌落，镜检为G杆菌者，取单个菌落，放入装有无菌蒸馏水的离心管内。
6. 细菌的PCR鉴定：将混悬有单个菌落的离心管煮沸5分钟，离心1164×g 5分钟，取上清备用。总反应体系50μl，三蒸水30μl，10×Buffer缓冲液5μl，2.5mMMg2＋，5μl， dNTP(含4种脱氧核苷酸1.25mM)4μl，Taq DNA聚合酶2.5U，引物（P1P2）50pmol/μl各0.5μl，模板DNA5μl。在0.5ml的离心管中，依次加入以上试剂，混匀，加入20μl石蜡油，进行PCR反应。PCR反应程序：预变性94℃5分钟，变性94℃ 60秒，退火60℃ 60秒，延伸72℃ 90秒，35次循环，延伸72℃ 10分钟。取扩增产物10μl，加样于质量浓度为2％的琼脂糖（含0.5mg/L溴化乙锭）凝胶，以1kb DNA ladder为分子量大小参照物电泳，电泳结果在紫外光下观察照相。
设置反应组P.i ATCC 25611的DNA为模板作阳性对照：加除P.i ATCC 25611的DNA模板外的PCR系统所有其他成份及加P.i ATCC 25611的DNA模板不加引物为阴性对照：分别对8种标准株细菌和临床分离株进行PCR鉴定。结 果
1. 引物特异性的检测
该引物只与P.i ATCC25611反应，产生855bp的特异片段，而不与P.g ATCC 33277, P.g W83, P.n 37665, P.m ATCC 25845, P.a ATCC25260, P.c ATCC 33574, P.d ATCC 33185反应。证明该引物特异性强，可用于P.i临床株的检测。本研究共对614株临床分离的黑色素G－厌氧杆菌株进行了PCR鉴定，有112株被鉴定为P.i。