内皮素、P物质、降钙素基因相关肽在牙龈组织中的分布及作用
【摘要】 目的 探讨人牙龈组织中内皮素(ET)、P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)的分布、含量及作用。方法 应用免疫组织化学、组织化学方法及计算机图像处理技术，对20例正常人和20例慢性牙周炎患者的牙龈组织中ET、SP、CGRP等免疫活性物质进行了定性、定量的观察分析。结果 在牙周病患者牙龈组织中ET、SP、CGRP的含量比正常龈组织中有所增高，ET的含量显著增高(P＜0.01)。结论 病变组织中ET、SP、CGRP含量的增高，可能与牙周疾病的发生密切相关，且ET是表明牙周组织健康状况的非常敏感的指标之一。
【关键词】 内皮素 P物质 降钙素基因相关肽 牙龈 牙周炎分子生物学、细胞生物学及放射免疫微量测定技术的出现和发展，揭示人体中免疫活性物质不仅具有调控微血管通透性和局部血流的功能，同时与抗牙周感染也有密切的关系［1］。本研究试图揭示内皮素(ET)、P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)等免疫活性物质在牙龈组织中的分布及作用，以及这些物质的改变与牙周炎的关系。
材料和方法
1.研究对象
20例健康自愿受试者标本，来自于多生牙及阻生齿拔除的患者。标准：牙龈色泽正常，无红肿、无增生、无萎缩、无牙周袋、无病理性松动、无明显牙石、无全身系统性疾病。
20例中度牙周炎患者标本，来自于牙龈翻瓣术的患者。标准：牙龈组织充血水肿，有轻度龈缘破溃，易出血，牙周袋深度约3mm～4mm，X线检查牙槽骨吸收高度约在根长的1/3～1/2，牙齿松动Ⅰ～Ⅱ，牙石Ⅱ。
记录牙周临床指标：①牙龈指数(GI)：按Loe及Silness的标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度。②牙周袋探诊深度(PD)：袋底或龈沟底至龈缘的距离。每颗牙齿检查6个部位，颊舌面的近中、远中及中央，取均值。③拍曲面断层片(附表)。附表 受试者牙周临床指标
分组例数GI(
+SD)PD(
+SD)中度牙周炎组201.6±0.33.7±0.5正常对照组 2001.2±0.42.检查项目和方法
切除后的组织立即置于4%多聚甲醛内含0.2% 0.1mol/L苦味酸的0.1mol/L PB(PH7.4)固定剂中固定24小时，继之浸于30%蔗糖液中直至沉底，然后冷冻切片(片厚60μm)进行组织化学和免疫组织化学游离切片染色。
组织化学染色［2］：游离切片于0.1mol/L Tris-HCl(PH7.6)缓冲液漂洗，然后在下列孵育液中孵育1～2小时(37℃)：0.1mol/L Tris-HCl(PH7.6)；NBT 0.25mg/ml；NADPH 1mg/ml内含0.3%TX-100。不时于显微镜下观察，染色适度时切片置于0.1mol/L PBS中终止反应，如需要时用苏木素复染细胞核。最后切片贴附于覆有铬明矾—明胶膜载玻片上，空气干燥后，经逐级酒精(70%～100%)脱水，二甲苯透明，封片。
免疫组织化学染色应用SABC方法，切片经0.1mol/L PBS(3×5min)，然后在0.3%H2O2,孵育30分钟阻断内源性过氧化物酶，继用10%正常羊血清处理1小时。切片直接滴加一抗孵育48～72小时，一抗滴度为ET(1：200)。切片再进入生物素标记羊抗免IgG(1：200)孵育1小时及卵白素—生物素复合物(ABC 1：100)孵育1～2小时，用0.05%DAB和0.01%H2O2进行显色。最后切片贴附于覆有铬明矾—明胶膜载玻片上，甲基绿复染细胞核，空气干燥后，经逐级酒精(70%～100%)脱水，二甲苯透明，封片。每步骤均需经常搅动，同时各步骤之间用含有0.5%TX-100，0.01mol/L PBS(PH7.4)漂洗。全部样品随机各取一片用Quantimet 970图像分析并做统计学处理。
结 果正常牙龈组织：镜下观察发现小血管及毛细血管内皮细胞内均可见ET呈阳性反应，间质中可见NADPH-d阳性反应神经纤维，大多呈串珠样，还可见串珠样神经纤维与毛细血管相连接。SP及CGRP免疫活性神经纤维的分布与血管密切相连，有的地方可见同一神经纤维的SP及CGRP免疫组化染色均显示阳性反应，表明两者有共存的现象，有的地方尚可见SP或CGRP免疫活性神经纤维延伸至上皮下的基膜。
