变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株的构建及特征

    利用致病菌蛋白毒力因子制备疫苗是预防感染性疾病的有效手段。用提纯的细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)免疫鸡，将所获得的抗CAGTase抗体用于被动免疫获得了明显的抗龋效果。但由于变形链球菌(以下简称变链菌)所含CAGTase最少，提取十分困难，是妨碍CAGTase疫苗实际应用的主要原因。为解决这一问题，我们通过基因工程手段构建了变链菌CAGTase过度表达株，现报告如下。

    一、材料与方法

    携带CAGTase基因的大肠杆菌—链球菌穿梭质粒pZB1已由作者研究构建［1］，DNA操纵、采用pZB1对变链菌CAGTase缺陷株B29的转化、CAGTase酶活力测定、SDS-PAGE电泳和Western印迹按边专等的方法进行［2］。免疫印迹后，对阳性蛋白带行薄层扫描(波长=500 nm)以确定葡糖基转移酶(GTase)的表达水平。

    二、结果与讨论

    1.采用pZB1转化变链菌B29后分离到大量转化株，其中多数在MS琼脂上表现为粗糙菌落。根据转化株特征分别命名为B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33。这一结果证实变链菌在MS琼脂上的典型菌落形态与CAGTase相关。

    2.免疫印迹：免疫印迹显示野生株MT8148含二种能与抗CAGTase多克隆抗体反应的蛋白带，分别代表CAGTase(156KDa)和游离型葡糖基转移酶(CFGTase)(148KDa)；B29缺乏CAGTase而仅有CFGTase。B29(pZB1)-4的表达水平接近野生型变链株MT8148，B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33则过度表达CFGTase。薄层扫描结果表明，变链菌B29-33的表达量是变链菌MT8148的5倍。为了确定所表达GTase的存在部位，我们采用上清样本和菌体样本同时进行免疫印迹，结果表明B29(pZB1)-33和B29(pZB1)-11所表达的GTase主要位于细胞表面，少量分泌至菌体外；但B29(pZB1)-4过度表达出的CAGTase不全片段主要分泌至菌体外，其分子量约为100KDa，具有CAGTase抗原性。

    3.GTase酶的活力测定表明，所有含B29(pZB1)株均恢复了非水溶性葡聚糖合成能力。B29(pZB1)-33总酶活力约为MT8148的3～4倍，且前者的酶活力主要集中于菌体表面。

    迄今为止，本项研究所获得的CAGTase过度表达株在国内、外尚未见报告。通过这些CAGTase过度表达株，我们可进一步探索GTase在变链菌致龋机制中的作用。同时，由于变链菌葡糖基转移酶的量少，难以提取，阻碍了利用CAGTase作为抗龋疫苗的研究。因此，我们构建的这些CAGTase过度表达株，对于研制GTase抗龋疫苗可能有潜在的应用价值。

国家自然科学基金资助课题

作者单位： 430070 湖北医科大学口腔医学院

参考文献

1边专，樊明文，魏国贤，等.携带葡糖基转移酶基因链球菌—大肠杆菌穿梭质粒的构建.口腔医学纵横，1995，11：199.

2边专，樊明文，凌均.变形链球菌葡糖基转移酶基因缺陷型突变株特征的研究.中华口腔医学杂志，1996，31：344-347.