c-myc基因在牙齿发育中对细胞凋亡的调控研究

　　【摘要】　目的　观察牙齿发育过程中c-myc mRNA转录和蛋白表达与细胞凋亡的发生情况，探讨c-myc基因在牙齿发育中对细胞凋亡的可能作用。方法　利用原位末端标记法(TUNEL)、原位杂交及免疫组织化学技术分别对SD大鼠牙胚发育不同时期c-myc mRNA、蛋白的表达及细胞凋亡情况进行检测。结果　在牙齿发育的各期成釉器及间充质细胞中均有c-myc mRNA、蛋白阳性表达，早期表达明显，钟状期的表达减弱而牙体组织形成期成釉细胞、成牙本质细胞及间充质牙乳头细胞中c-myc表达又增强。而凋亡细胞早期集中出现在细胞生长中心处，牙体组织形成后星网层及牙乳头细胞中多见，成釉细胞、成牙本质细胞中散在。结论　c-myc基因在牙齿发育过程中不仅调节细胞生长、增殖、分化和成熟，可能对细胞凋亡也发挥着重要的调控作用。

　　【关键词】　c-myc基因　　细胞凋亡　　牙胚　　发育

　　研究发现c-myc蛋白介导细胞从休止状态转向增殖状态且与细胞凋 亡密切相关。c-myc蛋白参与转录调节、DNA结合及异源聚体形成的功能区都是调控凋亡必须 的可能结构。因此c-myc基因对细胞凋亡和细胞增殖的调节机制是基本相同的。c-myc基因表 达失调是细胞凋亡的主要原因之一［1，2］。但是c-myc基因的表达是否在牙齿发育 中对细胞凋亡的发生具有重要作用，尚未见报道。本研究通过观察SD大鼠牙胚发育中c-myc 基因的表达，进行了c-myc基因对细胞凋亡的内在调控作用的探讨。

材料和方法

　　1.动物模型及标本制备：选用纯系三月龄SD大鼠(上海产)20只，按雌雄4：1的 比例同笼，每天早晨8：00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓为妊娠0d。分别于妊娠13、15、17 、19d脱颈处死大鼠，切取胎鼠(E)头部置于40g/L的多聚甲醛中固定，另取出生后(P)1、3、 5、7d幼鼠，均取头部(沿正中线切开鼠头后分切)置入含盐酸、甲酸、冰醋酸的40g/L聚甲醛 液中充分固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水、石蜡包埋。行冠状和矢状面5μm切片，分别 用于TUNEL染色、原位杂交及免疫组织化学染色。

　　2.原位杂交检测c-myc基因的表达：石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2mol HCL和20 lg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥；用地高辛标记的c-myc cDNA探针于42℃ 杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤；20mg/L 正常羊血清封闭30分钟后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体2小时；经buffer1、buffer3漂洗 后，加新配制的显色液(NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT4.5μl、BCIP3.5 μl、左旋咪唑0.24mg/L)20μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明 、封片。

　　3.免疫组织化学检测c-myc蛋白的表达：石蜡切片脱蜡至水，经30lg/L H2O2封闭内源性 过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10min后，用正常羊血清封闭30min；加c-myc抗体( 兔抗鼠多抗，美国 Santa Cruz公司产品)置于4℃过夜，室温下复温1h后滴加生物素化羊抗 鼠二抗37℃反应30min；再加ABC复合物37℃孵育30min，DAB显色后，梯度酒精脱水，二甲苯 透明、封片。

　　4.原位末端标记法(TUNEL法)标记凋亡细胞：TUNEL法(试剂盒购自美国Oncor公司)：切片常 规脱蜡至水，室温下20ml/L的蛋白酶K消化15min；含30ml/L H2O2的PBS溶液中处理5min 后，加50μl的平衡液(TUNEL试剂盒原配)1min；再加含TDT酶反应液15μl，37℃孵育1.5 h后用预热的中止反应液中止反应(TUNEL试剂盒原配)；bufferl漂洗2次(15min/次)后加20 mg/L的正常羊血清孵育30min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2h；经buffer1 、buffer 3漂洗后，加新配制的显色液(NBT/BCIP显色系统)20μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精 脱水，二甲苯透明、封片。

结　　果

　　1.c-myc原位杂交检测结果：c-myc mRNA阳性反应可出现于细胞浆和细胞核为紫蓝 色颗粒或团块。牙胚发育的各期均有程度不一的c-myc mRNA表达。蕾状期成釉器中央细胞及 周围外胚间充质细胞为强阳性表达，帽状期成釉器以内釉上皮凹面中心为主的原发性釉结节 处、颈环处及牙乳头细胞阳性表达明显(图1)。在钟状期c-myc的表达方式基本同帽状期，但 表达程度明显减弱。进入牙体组织形成期，开始时成釉细胞、成牙本质细胞、星网层、牙乳 头细胞中表达增强；随着基质分泌，星网层、牙乳头细胞中表达逐渐减弱，但成釉细胞、成 牙本质细胞仍可见散在表达。