TGF-β1对人牙髓细胞内钙影响的激光共聚焦显微镜动态观察

〔摘要〕　目的：探讨TGF-β1信号转导过程与人牙髓细胞内钙〔(Ca2 + )i〕的关系。方法：体外培养人牙髓细胞经钙荧光指示剂Fluo-3负载后，用激光扫描共聚焦显微镜测定TGF-β1影响前后的人牙髓细胞内钙随时间变化情况。结果：TGF-β1(0.1 ng/L)使人牙髓细胞内钙先升高后降低，最后维持 在比加药前稍高的静息钙水平上。结论：通过TGF-β可引起牙髓细 胞内Ca2+水平的显著变化，证明Ca2+参与了人牙髓细胞TGF-β1信号转导过 程并参与将信号转入核内。

关键词　转化生长因子β；牙髓细胞； 激光扫描共聚焦显微镜

　　钙离子作为细胞内信号转导的第二信使参与诸如肌肉收缩、神经传导以及细胞增殖与分 化等多种重要生理活动，细胞内钙离子浓度变化是细胞重要的信息系统，细胞在外界或不同 生理、病理状态下胞内钙离子浓度都会发生相应变化。

　　牙髓细胞或部分牙髓细胞具有分化成成牙本质细胞及生成牙本质的潜能，牙髓细胞在其分化 、增殖及矿化过程中受包括多种生长因子在内的多因素的调节，各种因素引起的细胞内钙的 不同变化是牙髓细胞增殖、分化以及矿化的重要环节。转化生长因子β（Transforming gro wth factor-β,TGF-β）对人牙髓细胞增殖具有双向调节功能〔1,2〕，在牙本质 修复过程中 对牙髓细胞向成牙本质细胞分化有重要促进作用〔3〕。本研究采用体外培养牙 髓细胞， 利用激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope,LSCM）动态观察TGFβ1 对牙 髓细胞内Ca2+浓度的影响，为进一步探明TGFβ1对牙髓细胞调节的信号转导机制提 供依据，为研究牙髓细胞分化及牙本质形成机制奠定基础。

1　材料和方法

1.1　试剂

　　D-Hank液(g/L):NaCl 8.00， KCl 0.40, Na2HPO·4.12H2O 0.12, KH2PO4 0.06 , D-Glucose 1.00,NaHCO3 0.35,采用国产分析纯试剂和超纯水（18.2 MΩcm）配制。Fluo -3/AM系美国BIO-RAD产品；胰蛋白酶由华美生物工程公司购得；小 牛 血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供；DMEM培养基由美国GIBCO公司提供，TGF-β 1系美国PROMEGA公司产品。

1.2　牙髓细胞培养

　　选13～20岁因正畸或阻生拔除的完整新鲜恒牙（第一前磨牙及第三磨牙），劈冠取出牙髓组 织，剪成1 mm3碎块，铺于培养瓶底，以含体积分数(φ)为10%胎牛血清（FBS）的DMEM培 养液，φ(CO2为5%，φ(空气)=95%，饱和湿度，37 ℃孵育做原代培养，取生长良好的第 4代牙髓细胞接种在特制培养皿中 ，接种浓度2.5×108/L，细胞贴壁后进行实验。

1.3　实验分组（每组复种两个培养皿）

　　对照组：φ(FBS)=10%的DMEM

　　实验组：用φ(FBS)=10%的DMEM配制的质量浓度为0.1 ng/L的TGF-β1溶液

1.4　牙髓细胞内Ca2+测定

1.4.1　测定原理　Fluo-3能特异性地与钙离子结合，并在一定 波长激发光激发后产生荧光，且与钙离子结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca 2+浓 度成正比，因而可用于观察Ca2+动态变化〔4〕。但Fluo-3为极性大的酸性化 合物，难以进入 细胞，而当其结合上亲酯的乙酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM，再与细胞孵育时，便很 容易透过细胞膜，胞浆内的非特异性酯酶将其脂解脱去脂基生成游离的Fluo-3。

1.4.2　D-Hank液（pH7.4）洗涤标本2次后，于37 ℃避光条件下用D-Hank液稀释的Fluo -3/AM（10 μmol/L）荷载，40 min后再用D-Hank液洗涤细胞3次，最后保留少许细胞外 D-Hank液平衡10 min〔5〕，LSCM下观察。

1.4.3　激光共聚焦图像　LSCM能对活细胞内部的离子分 布及随时间的变化进行成像及测量。本实验使用的是BIO-RAD公司的MRC-1024　LSCM。在 观察C a2+快速变化时，可选线扫方式，其采样频率为488 Hz，与Ca2+结合的Fluo-3 可以被488 nm的 氩离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度 的相对变化。

1.4.4　加药　在LSCM下选好细胞后，用微量加药器将实验条件要求的试剂滴加在培养皿 中，试剂扩散后进行观察